硝基咪唑類藥物測定方法——薄層色譜法

時間：2023-03-24 23:38:13來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

硝基咪唑類藥物測定方法——薄層色譜法

[db:作者] / 2022-12-21 00:00

16.1.4.2 測定方法

生物基質中硝基咪唑類藥物的殘留分析主要有免疫學方法(IA)、毛細管電泳法(CE)、薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)和氣相色譜法(GC)。早期研究集中于單個或幾個化合物的分析，現在多殘留高通量分析方法得到了較快發展。隨著質譜的推廣以及該類藥物“零殘留量”的執行，使得液相色譜-質譜(LC-MS)和氣相色譜-質譜(GC-MS)方法成為研究主流。

(1)薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)

TLC系將適宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或鋁基片上，成一均勻薄層。待點樣、展開后，根據比移值(Rf)與適宜的對照物按同法所得的色譜圖的比移值作對比，用以進行藥物的鑒別、雜質檢查或含量測定。TLC是快速分離和定性分析少量物質的一種很重要的實驗技術。Meshram等用TLC測定MNZ和咪康唑硝酸鹽。固定相使用硅膠(silica gel 60 GF254)，展開劑為甲苯-氯仿-甲醇(3.0+2.0+0.6，v/v)，在240nm波長顯像光密度計檢測。MNZ、咪康唑硝酸鹽的保留因子分別為0.34和0.55；MNZ線性范圍為300～700ng/點，咪康唑硝酸鹽線性范圍600～1400ng/點；采用標準加入法測得MNZ和咪康唑硝酸鹽的回收率分別為100.13%±1.59%(點高度)、98.92%±0.76% (點面積)和99.49±1.58% ( 點高度)、99.63%±1.46%(點面積)。但該方法未對組織中殘留樣品進行測定。高效薄層色譜法(high performance thin layer chromatography，HPTLC)由經典的TLC發展而來，優點是點樣量少，分析時間快，分離度和分辨率好，對樣品處理要求最低，操作最簡便，LOD可達納克(ng)至皮克(pg)水平。Gaugain等報道了用HPTLC測定豬和家禽組織中DMZ、RNZ、DMZOH殘留的方法。固定相為HPTLC級硅膠(10cm×10cm或20cm×10cm)，展開劑為甲醇和乙酸乙酯，先用甲醇洗脫3mm，吹干后再用乙酸乙酯洗脫4min，展開后噴吡啶，紫外光312nm檢測。RNZ、DMZ、DMZOH的LOD分別為2μg/kg、4μg/kg、5μg/kg，但未對樣品進行定量。

(2)毛細管電泳法(capillary electrophoresis，CE)

CE是以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，依據樣品中各組分之間淌度和分配行為的差異而實現分離的分析方法。在一定的電解質溶液中硝基咪唑類藥物都帶電荷，帶電粒子在電場作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移而達到分離。Lin等采用CE測定了豬肉中5種硝基咪唑類藥物。分離在未涂層熔融石英毛細管(50cm×50um i.d.)完成，背景電解質采用pH3.0緩沖液(包括25mmol/L磷酸鈉-0.1mmol/L溴化四丁胺)，進樣時間5s，壓力0.5psi，28kV分離電壓，選用紫外檢測器，在320nm波長檢測。方法LOD為1.0ug/kg，LOQ為3.2μg/kg；回收率為85.4%～96.0%，CV為1.3%～3.92%。Hernandez-Mesa等建立了牛奶中硝基咪唑藥物及其代謝物的CE分析方法。分離在未涂層熔融石英毛細管(61.5cm×50umi.d.)完成，泡沫細胞毛細管(bubble cell capillary)光通路，長度150um，檢測波長320nm，背景電解質為20mmol/L磷酸緩沖液(pH6.5)和150mmol/L SDS混合溶液，溫度20℃，25kV正電壓。單個樣品測定時間小于18min。MNZ、MNZOH、DMZ、RNZ、HMMNI、IPZ、IPZOH、ORZ和TIZ的LOD在0.94～1.8μg/L之間，LOQ為3.13～6.0μg/L，回收率為57%～97.8%。

(3)氣相色譜法(gas chromatography，GC)

GC分離測定具有快速、高效的特點，但只是常規分析法，不能確證分析。在硝基咪唑類藥物許可使用的時期，GC方法得到一定研究，但隨著硝基咪唑類藥物的禁用，對檢測特異性和靈敏度要求提高，GC方法研究逐漸減少。

RNZ、MNZ、SNZ和ORZ帶有羥基，極性較強，熱穩定性差，需將羥基通過活潑氫進行硅烷化衍生成極性較弱的衍生物，從而改善揮發性和熱穩定性，衍生后增加化合物的分子量，更易于檢測。常用的硅烷化試劑主要有N，O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)和N，O-雙(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSA)。而衍生化后的硝基咪唑類藥物，主要用低極性色譜柱進行分離。Wood測定血液中MNZ時，在氯仿提取物中加入BSTFA過夜后，經GC-火焰離子化檢測器(flame ionization detector，FID)檢測，色譜柱為3% OV-1柱(183cm×0.04cm)。以肉豆寇醇(myristyl alcohol)為內標，平均回收率為102.9%，LOD為1 ug/mL。Bhatia等建立了測定血液中硝基咪唑類藥物GC方法。MNZ、ORZ和SNZ用BSTFA在室溫衍生1h，吹干后，用環已烷復溶，進GC-電子俘獲檢測器(electroncapture detector，ECD)測定。衍生化引入了氟元素，增加了揮發性、靈敏度，減小了色譜柱吸附效應。而TIZ本身含有硫原子，不衍生直接測定，也對ECD敏感。GC色譜柱為3%OV-11玻璃柱(150mm×4mm)。方法回收率為81%～89%，CV小于5%，LOD為100ng/mL。

硝基咪唑類藥物結構中含有多個氮原子，沸點較低，提取凈化后也可以不衍生直接進行GC-氮磷檢測器(nitrogen-phosphorus detector，NPD)檢測。Wang等建立了禽肉中DMZ、RNZ和MNZ殘留檢測的GC-NPD檢測方法。樣品經乙腈提取后用乙酸酸化，過SCX柱，用乙腈-甲醇(72+28，v/v)洗脫，洗脫液吹干后溶于甲醇，無需衍生直接GC分析。毛細管氣相色譜柱為5%二苯基/95%二甲基聚硅氧烷柱(25m×0.32mmi.d，0.52mm)，進樣口和檢測口溫度分別為250℃和300℃，不分流進樣，溶劑延遲1.0min，升溫程序為：80℃維持1min，以25℃/min升溫至173℃，以2℃/min升至185℃，以30℃/min升至260℃，維持3min，氮氣為載氣，流速1.5mL/min，氮氣補充氣30mL/min，氫氣4mL/min，空氣120mL/min，以磷酸三苯酯(triphenylphosphate)為內標定量。DMZ、RNZ和MNZ的回收率分別為85%、90%和80%，CV分別為13.0%、14.3%和11.2%；DMZ和MNZ的LOD為0.2ng/g，RNZ為0.5ng/g。

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