吡唑酮類藥殘留分析技術前處理——凈化方法

時間：2023-03-25 00:56:39來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

吡唑酮類藥殘留分析技術前處理——凈化方法

[db:作者] / 2022-12-20 00:00

(3)凈化方法

吡唑酮類藥物殘留分析的凈化方法主要采用液液分配(LLP)和固相萃取(SPE)方法。

1)液液分配(liquid liquid partition，LLP)

LLP主要通過調(diào)節(jié)溶液的pH，改變吡唑酮類藥物在水相和有機相中的分配系數(shù)，從而達到去除脂溶性和水溶性雜質的目的。

Clark等用LC-MS確證牛腎臟中的保泰松，利用保泰松的酸性特性，樣品用等質量的水稀釋后，用25%氨水堿化，加入乙酸乙酯-乙醚混合溶液進行LLP，離心，棄去有機層，脫去脂溶性雜質，然后用6mol/L HCI酸化氨水提取液，再與四氫呋喃-正己烷(1+4，v/v)進行LLP，將藥物轉移至有機相，棄去水溶性雜質，然后進行固相萃取凈化，LC-MS確證檢測。方法LOD為5～10μg/kg，但未測定回收率。

Shively等測定唾液中安替比林和氨基比林，1mL樣品加1mL 1mol/L氫氧化鈉溶液堿化稀釋，再與1mL氯仿LLP提取凈化，收集下層的氯仿提取液，蒸干后復溶于二氧己環(huán)，進GC測定。安替比林和氨基比林的線性范圍均為0～10μg/mL，CV分別為1.7%和2.4%，回收率為87%和95%。

由于安乃近代謝物極性強，在固相萃取柱上保留很弱，經(jīng)過固相萃取柱凈化損失較大，因此沈金燦等在測定牛奶和奶粉中安乃近的4個代謝物(FAA、AAA、MAA和AA)殘留時，在樣品加入Tris溶液后，用乙腈提取，乙腈提取液與正已烷進行LLP脫脂，提取液中的脂肪得到有效去除。MAA的LOD為0.24ug/kg，AA為0.59ug/kg，AAA為0.20μg/kg，F(xiàn)AA為0.61μg/kg。在添加量5～20ug/kg范圍內(nèi)，4種安乃近代謝物的回收率在80.4%～97.9%之間，RSD均小于9%。Penney 等測定牛奶、牛肉、豬肉中安乃近及其代謝物殘留時，直接用甲醇提取，提取液與正己烷LLP脫脂后直接進HPLC分析。牛奶和豬肉樣品的CV小于11%，牛肉樣品稍大；平均回收率為82%～128%， FAA、AA和MAA的LOD均小于0.02mg/kg，安乃近的LOD小于0.13mg/kg。

2)固相萃取(solid phase extraction， SPE)

根據(jù)吡唑酮類藥物酸堿性和極性的差異，選擇不同的SPE柱進行凈化。酸性的保泰松、羥布宗等主要采用C18、苯基、硅膠、硅酸鎂、氨基柱、HLB等SPE柱凈化，堿性的安替比林、安乃近代謝物等主要采用C18、氧化鋁等SPE柱凈化。

A. 酸性藥物

a. 反相SPE柱

保泰松和羥布宗顯酸性，在酸性條件下，增加了反相色譜保留作用，改善了凈化效率。Taylor等測定馬血漿中保泰松和羥布宗，血漿用PBS溶液稀釋后，用C18 SPE柱凈化，依次用PBS溶液和正已烷淋洗，用乙酸乙酯-正己烷(1+1，v/v)洗脫，HPLC測定。保泰松和羥布宗的回收率分別為53.5%～63.1%和43.3%～47.2%，CV分別為5.1%和4.0%。液態(tài)樣品可直接用中性或酸性溶液稀釋后過SPE凈化，操作較為簡單。Simmons等提取血清中保泰松和羥布宗，三氯乙酸提取液上C18小柱凈化，用水淋洗，甲醇洗脫，SFC測定。保泰松和羥布宗的LOD分別為0.1μg/mL和1.0μg/mL，CV為0.24%～4.94%，回收率在82%～83%之間。Caturla等測定血漿中保泰松和羥布宗，應用檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)血漿pH3.4，上苯基SPE柱凈化，用正已烷-乙醚(1+1，v/v)洗脫，洗脫液吹干后流動相溶解，HPLC測定。方法回收率大于90%，CV小于7.5%。該方法的優(yōu)點是應用檸檬酸緩沖溶液可避免鹽酸提取時引起的藥物降解。

Dowling等報道了牛乳中保泰松殘留分析方法。乙腈提取液用等體積的10 mmol/L的維生素C溶液稀釋，再用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH3后，上Isolute C18 SPE柱凈化，依次用3 mL 10 mmol/L維生素C溶液和甲醇-水(10+90，v/v)淋洗，抽干后用3mL正己烷-乙醚(50+50，v/v)洗脫。方法的CCa和CCβ分別為0.70ng/mL和1.19ng/mL，回收率為105.3%，CV為6.7%。

Gentili 等測定牛奶和牛肉中保泰松等15種非甾體類抗炎藥物，牛奶用乙腈提取，牛肉用乙腈和丙酮提取，提取液濃縮后用水稀釋，過HLB SPE柱凈化，用6 mL正已烷淋洗，依次用甲醇和丙酮洗脫。LC-MS/MS 測定牛奶和牛肉中保泰松的CCa 分別為0.71 μg/kg和0.92 μg/kg，CCβ 分別為1.23 ug/kg和1.84 ug/kg，回收率在97%～99%之間。

b.正相SPE柱

Jedziniak等測定牛奶中的保泰松和羥布宗，乙腈提取液上氨基柱SPE凈化，用6mL甲酸-乙腈(5+95，v/v)洗脫，LC-MS/MS測定。實驗室內(nèi)CV為7%～28%，回收率為71%～116%。

龐國芳等分析牛、豬、羊、雞肌肉中的保泰松殘留時，將甲醇-0.25mg/mL二硫蘇糖醇的乙酸乙酯溶液(1+7，v/v)提取液吹干后，用5 mL甲醇-氨水-二氯甲烷-0.25 mg/mL二硫蘇糖醇的乙酸乙酯溶液(1+1+70+70，v/v)溶解，過VARIAN Bond Elut FL (硅酸鎂，2g) SPE柱，15 mL冰乙酸-甲醇-二氯甲烷-乙醚溶液(1+2+47+50，v/v)洗脫，洗脫液用氮氣吹至近干后，用流動相溶解，進HPLC檢測。方法回收率為89.0%～111.49%，RSD在8%以內(nèi)，LOD為5.0μg/kg。該研究還對甲醇、乙酸乙酯、甲醇-乙酸乙酯混合液作為SPE洗脫液的凈化效果進行了比較，發(fā)現(xiàn)甲醇洗脫會影響定量，采用冰乙酸-甲醇-二氯甲烷～乙醚溶液(1+2+47+50，v/v)洗脫雜質明顯減少，效果最好。

Clark等用LC-MS確證牛腎臟中的保泰松時，組織酸化后用四氫呋喃-正己烷(1+4，v/v)提取，提取液上硅膠SPE柱凈化，用四氫呋喃-正已烷(1+4，v/v)直接洗脫，確證LOD為5～10μg/kg，回收率未作測定。

正相機制SPE凈化，上樣樣品要盡量不要含有水分，否則影響回收率。

c. 復合SPE柱

Taylor等確證馬血漿中保泰松和羥布宗時，C18 SPE柱洗脫液吹干后，復溶于PBS緩沖液，再過Bond-Elut Certify柱(反相和陽離子交換復合填料)凈化，分別用甲醇-PBS緩沖液(1+9，v/v)、1.0mol/L乙酸和正己烷淋洗，二氯甲烷洗脫，衍生化后GC-MS確證測定。血液中添加濃度大于4μg/mL時，保泰松和羥布宗可得到確證。

B. 堿性藥物

a. 反相SPE柱

沈金燦等測定牛和豬肌肉組織中安乃近的3種代謝物FAA、AA和MAA殘留時，將2mL水相提取液加入Bond Elute C18 SPE中，依次用5mL水和5mL甲醇-水(5+95，v/v)淋洗，用5mL甲醇洗脫，LC-MS/MS測定。方法LOD為5μg/kg；測定范圍為5～150ug/kg；FAA、AAA、AA和MAA的回收率分別為81.6%～94.0%、81.2%～90.2%、82%～101%和75.0%～86.4%；CV小于7%。通過比較HLB、Bond Elute Certify、Bond Elute C18的富集和凈化效果，發(fā)現(xiàn)HLB柱對AA的回收率差，Bond Elute Certify對MAA的回收率差，而Bond Elute C18的回收率均比較理想。

b. 正相SPE柱

Jedziniak等測定牛肉中安乃近的4種代謝物(FAA、AAA、AA和MAA)殘留時，樣品的乙腈-乙酸鈉溶液提取液用氧化鋁SPE柱凈化，收集流出液進LC-MS/MS測定，回收率為45%～95%，CV為7%～30%；MAA的CCa和CCβ分別為113μg/kg和139μg/kg，F(xiàn)AA、AAA和AA的CCa和CCβ均在11.6～16.5μg/kg之間。

Engel等測定安替比林代謝物NORA時，體外肝微粒體酶孵育液用二氯甲烷提取，提取液蒸干后復溶于乙酸乙酯，過硅膠SPE小柱凈化，用6mL甲醇-乙酸乙酯(1+9，v/v)洗脫，棄去初始的2mL，收集后4 mL，衍生化后用GC-MS測定。NORA的LOQ為5 ng/mL，CV為19.4%和20.7%，回收率為80%～120%。因為安替比林、NORA與衍生化試劑N- (特丁基二甲基硅)-N-甲基三氟乙酰胺均生成相同的產(chǎn)物，干擾NORA測定。經(jīng)過硅膠柱凈化，安替比林仍保留在SPE小柱上，只有NORA被洗脫，避免了測定時的干擾。

3)分子印跡技術(molecular imprinting technology，MIT)

分子印跡技術是一種制備分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymer，MIP)的技術。由于MIP中具有和目標分子高度互補的功能基團和空腔結構，因此具有對目標分子較好的識別性能。何云華等以甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，合成了安乃近的MIP。所制備的MIP與安乃近存在兩類不同的結合位點，高親和力結合位點的離解常數(shù)為9.52×10-4 mmol/L，最大表觀結合量67.0 umol/g；低親和力結合位點的離解常數(shù)為8.71×10-3 mmol/L，最大表觀結合量為240.0 umol/g。其對氨基比林及安替比林的吸附量均較小，表明制備的安乃近MIP具有良好的選擇性。

4)液相微萃取(liquid phase microextraction， LPME)

LPME過程是基于分析物在樣品與有機溶劑之間分配平衡的過程，分析物在平衡時的萃取量達到最大。黃星等建立了尿液中氨基比林和安替比林的LPME-GC測定方法。在4 mL萃取瓶中加入攪拌磁子和3mL尿樣，調(diào)節(jié)至pH9，用10μL微量注射器抽取1 μL甲苯，將針尖浸入到樣液高度一半處，按下微量注射器的活塞，使萃取溶液形成一個小液滴懸掛在針尖上，溶液攪拌速度為170 r/min，萃取15 min后，拉回活塞，直接進GC分析。氨基比林、安替比林的CV為8.14%～16.8%，LOD 分別為1mg/L、4mg/L。

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