四環素類藥物殘留分析技術——測定免疫分析法

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

(2)免疫分析法(immunoassay，IA)

免疫分析法是以抗原與抗體的特異性、可逆性結合反應為基礎的分析技術，免疫分析技術最突出的優點是操作簡單，速度快、分析成本低。TCs殘留分析主要采用酶聯免疫吸附法(ELISA)、膠體金免疫層析法(GICA)和放射免疫分析法(RIA)。

1)酶聯免疫分析法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

ELISA是可以對大批樣本進行定性、定量測定的方法，具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、快速的特點。

Jeon等采用生物素與親和素介導的競爭性ELISA分析牛奶中的TC將TC與卵清蛋白偶聯制備羊抗TC多克隆抗體，結果LOD為0.048ug/L。使用該法處理的樣品無需凈化和稀釋，結果靈敏度高，并且所測的幾種物質未發現交叉反應。Zhang等合成三種新的免疫源制備兔抗TC多克隆抗體，建立間接競爭酶聯免疫吸附法(ic-ELISA)，添加回收率為74%～116%，新免疫原的合成可為牛奶中TCs殘留檢測提供新的篩選方法。Lee等采用半定量ELISA測定豬血漿中的OTC、CTC和TC含量。

Pastor-Navarro等合成TCs的酰胺和重氮衍生物選擇性半抗原，制備多克隆抗體，篩選蜂蜜中殘留TCs，LOD為0.4ng/mL，回收率達到79%～108%。該法提供了一步合成半抗原的新途徑，但物質的交叉反應均超過10%。Jeon等報道了基于生物素抗生物素介導的ELISA方法，測定蜂蜜中的TC。用pH7.2的PBS-EDTA測定緩沖液配置和稀釋TC標準品，不需要任何前處理，直接ELISA測定。方法LOD為0.19μg/L，LoQ為0.38μg/L，回收率為95%～101%，與結構相似物沒有發現交叉反應。

Le等基于金霉素-牛血清白蛋白(CTC-BSA)作為免疫原產生的單克隆抗體建立了快速、靈敏測定動物組織中CTC殘留的ELISA方法。改進的ELISA方法中半數抑制濃度(IC50)為0.66ng/mL。雞肉和雞肝中CTC的添加回收率范圍分別為78.8%～92.2%和80.3%～90.2%，CV分別為3.2%～9.5%和6.5%～10.2%；LOD分別為0.06ng/g和0.07ng/g。該作者還應用高靈敏度和特異性單克隆抗體建立了改進的ic-ELISA測定雞肉和雞蛋中DC殘留。應用雜交瘤技術制備DC單克隆抗體，測定靈敏度、特異性，精密度和準確度等參數對改進的ic-ELISA方法進行了評價。在最佳實驗條件下，在0.01～100ng/mL范圍內繪制標準曲線，IC50值為(1.32±0.18)ng/mL，LOD為(0.14±0.02)ng/g；添加水平為50～600ng/g時，雞肝、雞肉和雞蛋中DC的回收率分別為84.6%～85.5%、88.2%～89.1%和84.4%～～89.3%，CV分別為5.1%～9.3%、3.7%～11.3%和4.7%～9.8%。

2)膠體金免疫層析法(colloidal gold immunochromatographic assay，GICA)

GICA因其快速、簡便、靈敏度高的優點成為近幾年用于牛奶、雞蛋中TCs殘留檢測的新方法。

檀尊社等建立了快速檢測水產品中TCs殘留的GICA方法。采用競爭模式，將抗TC單克隆抗體-膠體金復合物包被在膠體金結合墊上，并將人工合成的TC抗原包被在硝酸纖維素薄膜表面作為檢測線，殘留藥物與待測樣品中TC競爭結合膠體金標記的TC單克隆抗體，以顏色直觀顯示檢測結果。試劑靈敏度最低值可達100ng/mL，僅需5～10min，與CTC、OTC、DC等TCs有很強的交叉反應，而與沙丁胺醇、萊克多巴胺等其他獸藥無交叉反應。方瑩等也建立了快速檢測TC殘留的GICA方法。將制備的膠體金顆粒與抗TC單克隆抗體結合形成抗TC單克隆抗體金標復合物標記在膠體金結合墊上。并將TC人工抗原包被在硝酸纖維素膜上作為檢測線，待測樣品中相應TCs競爭結合膠體金標記的抗TCs單克隆抗體，以顏色直觀顯示檢測的定性結果。檢測肉類樣品，靈敏度最低值可達到10ng/mL，只需3～5min，與其他獸藥無交叉反應。Le等建立了一種利用膠體金標記單克隆抗體一步側流免疫層析技術快速檢測豬組織中DC殘留的方法。為了進行測定，引入了一個對其他TCs具有較低交叉反應的DC膠體金標記單克隆抗體，命名為2.3/3A6。測試帶對DC的靈敏度低達7ng/mL，IC50為(22±2)ng/mL。該測試可在10min內完成，裸眼視覺評估LOD為20ng/mL；在20ng/g、40ng/g和80ng/g三個水平，添加回收率分別為81%～95%(肌肉)、81%～92%(肝臟)，日內和日間CV分別為3%～6%和4%～8%。

3)放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)

RIA是一種應用放射性同位素的敏感性和抗原抗體反應的特異性結合而成的體外微量分析方法，原理使放射性標記抗原和未標記抗原(待測物)與不足量的特異性抗體競爭性地結合，反應后分離并測量放射性而求得未標記抗原的量。

Meyer等將一種商業化的適用于血液、尿液、牛奶和組織中TCs分析的RIA方法，改進用于水樣中TCs的分析，方法LOD約為1.0ppb，半定量水平為1～20ppb。檢測結果通過了液相色譜-質譜(LC-MS)的確證。

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