四環素類藥物殘留分析技術——前處理方法（一）

時間：2023-03-25 01:53:47來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

四環素類藥物殘留分析技術——前處理方法（一）

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

12.1.4.1 前處理方法

(1)提取方法

TCs在弱酸性溶液中比較穩定，此外，TCs分子能與多種金屬離子形成整合物或絡合物，易于與基質蛋白質和固定相中的硅醇基鍵合，因此，常在弱酸性溶劑中加入Na2EDTA來提取TCs。常用的提取溶劑包括Mcllvaine緩沖溶液、Na2EDTA溶液、檸檬酸溶波、磷酸鹽、氨水、水8、20%三氯乙酸溶液、乙腈(1mmol/L三氯乙酸調pH4.0)、Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液、EDTA-Mcllvaine緩沖溶液-乙腈、Mcllvaine緩沖溶液-乙腈、EDTA-乙腈、0.1mol/L琥珀酸鈉溶液(pH4.0)琥珀酸鹽(0.1mol/L，pH4.0)-甲醇、檸檬酸鹽緩沖液-乙腈和草酸-乙腈等。TCs檢測常用的樣品提取方法有液液萃取(LLE)、超聲輔助萃取(UAE)、加速溶劑萃取(ASE)、液相微萃取(LPME)等。

1)液液萃取(liquid liquid extraction，LLE)

LLE 是獸藥殘留分析中最常用的提取方法。通過機械性振蕩，用試劑將分析物從液態/固態樣品基質中提取出來其特點是簡單，但也有易于乳化，消耗試劑多等缺點。

Wang等利用高溫態水的化學行為與有機溶劑相似的原理，采用亞臨界水提取技術對樣品進行預處理，以5.5mL的水在100℃下加熱5min(鹽酸調pH2.0)提取動物性食品中的CTC、OTC殘留，高效液相色譜(HPLC)檢測，回收率為為82.1%～90.0%。與采用乙酸乙酯作提取溶劑的超聲提取方法進行比較，后者對幾種抗生素的提取率僅為為52.0%～74.2%。結果表明高溫態亞臨界水的提取效率高，且樣品無需凈化和濃縮，避免了使用有機溶劑對環境造成的污染蓖麻屬Castellari等采用氨水提取豬和牛毛發中的OTC。取250mg干凈的毛發用8mL 0.1mol/L氨水在40℃水浴中超聲提取30min，0.5mol/L鹽酸中和提取液，25mL EDTA-Mellvaine緩沖溶液(pH4.0)稀釋，SEP-PakPlusC18柱凈化，超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)檢測。OTC的檢出限(LOD)為9.2ng/g。連文浩等采用Na2 EDTA-Mcllvaine緩沖溶液(pH4.0)提取鰻魚組織中的CTC、TC、OTC 5.0g鰻魚組織中加入20mL Na2EDTA-Mellvaine緩沖溶液，渦動混合，以4000r/min轉速離心10min，水層移入150mL分液漏斗中，離心管內的殘留物按上述步驟重復提取一次，合并水相到同一分液漏斗中加入正已烷20mL，用振蕩器劇烈振蕩5min后靜置分層，固相萃取柱(SPE)凈化，UPLC-MS/MS分析方法的平均回收率為70.6%～93.4%，相對標準偏差(RSD)為6.3%～10.5%，定量限(LOQ)為5.0μg/kg。Li等以0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液提取，在線SPE-HPLC檢測蜂蜜中五種TCS分別用甲醇、Na2EDTA-Mllvaine溶液預先活化以C18為固相吸附劑的SPE柱，測得在50～1000ng/g濃度范圍內幾種TCS的線性關系良好，LOD為5～12ng/g。楊等開發了基于雙水相萃取的離子液體-陰離子表面活性劑萃取方法，應用于蜂蜜中TC和OTC的提取樣品用Na2EDTA溶液混合，再加入十二烷基硫酸鈉、離子液體1-辛基-3-甲基咪唑溴化物和氯化鈉，超聲振蕩，離心，形成了含水的兩相，分析物在上層溶液中作者對影響提取效率的因素，如離子液體的體積、鹽的種類和量、pH值、提取時間和溫度等也進行了比較研究.在優化條件下，TC和OTC的回收率在85.5%～110.9%之間，RSD小于6.9%，LOD分別為5.8μg/kg和8.2μg/kg。宋等也開發了一種基于離子液體的液液微萃取方法提取雞蛋中的TC、OTC、DC和CTC離子液體1-丁基-3-甲基咪唑镎六氟磷酸鹽被證明具有最佳的性能在優化條件下，方法回收率在58.6%～95.3%之間，CV小于6.2%，LOD為2.0～12ng/g。

2)加速溶劑萃取(加速溶劑萃取)

ASE是指在高的溫度(50～200℃)和壓力(1000～3000psi或10.3～20.6MPa)下，用溶劑萃取固體或半固體樣品的新穎樣品前處理方法。與傳統提取方式相比，ASE速度快、溶劑用量少、萃取效率高、待測組分回收率好，可實現全自動安全操作，在TCs殘留分析的前處理也有文獻報道。

Yu等采用ASE提取豬、雞和牛肌肉、肝臟中的CTC、TC、OTC、MNC、MTC、DMCT和DC殘留。乙腈(1mmol/L三氯乙酸調pH4.0)為提取溶液，經優化后的ASE的最佳條件為：壓力65bar，溫度60℃，靜態萃取時間5min，靜態循環2次，沖洗溶劑體積為池容積的50%。HPLC檢測，方法的LOD和LOQ分別小于10μg/kg和15μg/kg，平均回收率為75.0%～104.9%，變異系數(CV)低于10%。Blasco等建立了ASE方法提取牛、豬、家禽和羔羊肌肉組織中CTC、TC、OTC和DC殘留。水為提取溶液，經優化后的ASE的最佳條件為：壓力1500psi，溫度70℃，靜態萃取時間5min，靜態循環1次，沖洗溶劑體積為池容積的60%，提取液經HLB柱凈化，高效液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)檢測。方法平均回收率高于89%，日內和日間CV分別低于15%和17%；LOQ為0.5～1.0μg/kg，檢測限(CC)和檢測能力(CCβ)分別為101～116μg/kg和112～130ug/kg。

3)超聲輔助萃取(ultrasonic-assisted extraction，UAE)

UAE是利用超聲波輻射壓強產生的強烈機械振動、擾動、乳化、擴散、擊碎和攪拌等多級效應，增大物質分子運動頻率和速度，增加溶劑穿透力，從而加速目標成分進入溶劑，促進提取的進行：優點是萃取速度快，價格低廉、效率高。也有報道采用UAE技術來提高TCs的萃取效率。

Zhou等采用Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液(pH4.0)提取蜂膠中的CTC、TC、OTC、DC，在2.0g蜂膠中加入20mL的Na2EDTA-Mllvaine緩沖溶液，超聲輔助萃取30min(50℃，100W，40kHz)，SPE凈化，HPLC檢測。方法的LOQ為100～150ng/g，回收率為61.9%～88.5%，CV為4.80%～13.2%。

Zhao等測定牛奶中的OTC、TC、CTC、MTC和DC時，10mL牛奶用1mol/L鹽酸調pH4.0，超聲波輔助萃取5min，8000g離心10min，取上清液，30mL正已烷萃取2次，取下層的水相。有機相用2mL水洗滌1次，水相真空旋蒸濃縮至小于10mL，甲醇定容至10mL，0.22um濾膜過濾，取20uL進樣，HPLC分析。方法的回收率為88%，CV低于4.3%，LOD為10～25ng/mL。

4)液相微萃取(liquid phase microextraction，LPME)

LPME是一個基于分析物在樣品及小體積的有機溶劑(或受體)之間平衡分配的過程，是在LLE的基礎上發展起來的。與LLE相比，LPME可以提供與之相媲美的靈敏度，甚至更佳的富集效果；同時，該技術集采樣、萃取和濃縮于一體，靈敏度高，操作簡單，而且還具有快捷、廉價等特點；另外，它所需要的有機溶劑也是非常少的(幾微升至幾十微升)，是一項環境友好的樣品前處理新技術，特別適合于環境樣品中痕量、超痕量污染物的測定。

Shariati等建立了載體介導的中空纖維LPME方法，提取和凈化牛奶、人血漿和水樣品中的TC、OTC、DC。11.0mL樣品和0.05mol/L Na2HPO4(9.1≤pH≤9.5)加到有4mm×14mm攪拌棒的12.0mL小瓶中，放置到攪拌器上，用25uL的微量注射器吸取25μL提取緩沖液(0.1mol/L h3PO4，1.0mol/L NaCl，pH1.6)，將針頭插入中空纖維的管中，將中空纖維浸入10%季銨鹽(Aliquat-336)-辛醇溶液中(w/v)約10s，使針頭中充滿該溶液，然后將中空纖維浸入水中約10s，以去除中空纖維表面的季銨鹽(Aliquat-336)-辛醇溶液；緩慢推出微型注射器的柱塞使提取溶液進入中空纖維，用鋁箔封閉中空纖維的一端，將中空纖維放入樣品小瓶中，提取35min后取出中空纖維，微型注射器吸取提取溶液，直接進樣HPLC分析。方法的萃取百分率為24.8%～44.5%，CV為4.3%～8.9%，LOD為0.5～1.0μg/L。

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