喹諾酮類藥物殘留分析技術測定方法（五）

時間：2023-03-25 02:41:16來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

喹諾酮類藥物殘留分析技術測定方法（五）

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

(8)免疫分析法(Immunoassay，IA)

免疫學分析方法以抗原抗體的特異性反應為基礎的，以高特異性、高靈敏度著稱，可使分析過程簡化，適合復雜基質中痕量組分的分析。QNs結構中含有羧基，故多采用羧基與載體蛋白游離氨基進行反應，將QNs與載體連接合成人工抗原，進而免疫動物產生特異性抗體。由于QNs的主要結構部分相同或相似，因此某一QNs的抗體通常對其他QNs存在--定的交叉反應。常采用的方法主要有酶聯免疫吸附(ELISA)、膠體金免疫層析(CGIA)、化學發光酶免疫分析(CLEIA)、熒光偏振免疫分析方法(FPIA)和磁微粒酶聯免疫技術(MPEIA)等。

1)酶聯免疫分析法(enzymelinkimmunosorbentassay，ELISA)

ELISA已廣泛應用于獸藥和農藥殘留的快速篩選檢測。大多數ELISA方法的標記物是酶，但是也有應用其他標記物建立的方法，如化學發光法和電化學法。相對于微生物學方法和色譜方法而言，ELISA方法可以適用于大量樣本的快速分析，靈敏度高，成本低，不需要昂貴復雜的儀器，在殘留檢測中有著非常突出的優勢。除了常用的96孔酶標板，一些實驗室已經開始使用384或1536孔的酶標板，可以顯著提高工作效率。

姜金慶等建立了同時檢測多種QNs的ELISA分析方法。以碳二亞胺(EDC)二步法合成CIP人工抗原，免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，建立QNs藥物多殘留的ELISA檢測方法。標準曲線在PBS中的線性檢測范圍為0.2～376ng/mL，IC50為8ng/mL，LOD為0.1ng/mL；抗體對ENR、NOR和PEF均能特異性識別，IC50值分別為7.3ng/mL、10.6ng/mL和13.2ng/mL；標準品稀釋液中NaOH和甲醇的最高容忍度分別為10%和30%。牛奶中添加5ng/mL、20ng/mL和50ng/mL的標準品，CIP、ENR、NOR和PEF的回收率分別為93%～108%、96%～110%、92.5%～104%和93%～102%。Bucknall等制備了NOR的多克隆抗體，采用ELISA檢測牛奶、羊腎臟中NOR、ENR、CIP、FLU和NAL殘留，方法的回收率為64.2%～110.6%，日內和日間RSD分別低于11.2%和10.5%，LOD低于4mg/kg。

Huet等制備的SAR單克隆抗體對SAR、NOR、FLU等15種QNs都有交叉反應性。雞肌肉、雞蛋、腎臟等組織經甲醇磷酸鹽提取后，用建立的ELISA方法進行檢測，LOD為10～200ng/g。Lu等以PEF為半抗原，與牛血清白蛋白偶聯，免疫動物制備抗體，該抗體具有高敏感性，在緩沖液中對PEF的IC50為6.7ppb，對FLE、ENR、OFL的交叉反應性分別為116%、88%和10%，在0.5ppb、5ppb、10ppb、50ppb和100ppb添加水平，平均回收率為87%～103%，日間和日內RSD分別低于為13.6%和10.9%，方法的LOQ為0.5ppb。VanCillie等利用制備的FLU人工抗原免疫產蛋雞，收集雞蛋并對IgY進行分離、鑒定，建立間接競爭ELISA方法，用于測定牛奶中的FLU。生牛奶中FLU的LOD為12.5ug/kg，平均回收率為73.7%。Sheng等建立了檢測牛奶中OFL、MAR和FLE的直接競爭ELISA方法，LOD為0.20～0.53ng/mL。Holtzapple等制備了SAR的單克隆抗體和多克隆抗體，使用分子力學和量子力學的方法獲得了的三維分子模型，并討論了交叉反應與結構的關系和不同結構部分對免疫結合反應的作用，使得對待測物與抗體的結合有了更好的理解，由此也說明利用計算機和分子模型技術設計半抗原和預測抗體選擇性是可行的。Jiang等以辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔二抗來識別磺胺類藥物(SAs)的多克隆抗體，以堿性磷酸酶ALP標記羊抗鼠二抗來識別QNs單克隆抗體，從而實現在同一個反應體系中同時檢測牛奶中22種SAs和13種QNs殘留的雙顯色酶聯免疫吸附試驗(DC-ELISA)。該DC-ELISA方法對SAs和QNs的LOD分別為5.8μg/L和2.4μg/L；SAs和QNs在牛奶中10～100μg/L添加濃度，SAs的添加回收率為67%～101%，CV為8.1%～16.4%；QNs的添加回收率為72%～105%，CV為4.8%～9.3%。

2)膠體金免疫層析法(colloidalgold-based immunochromatographi cassay，CGIA)

CGIA是20世紀70年代開始發展起來的一種以膠體金作為標記物，讓其和蛋白質等各種大分子物質結合，再利用抗原抗體反應以達到檢測目的的一種新型的免疫標記技術。膠體金技術具有方便快捷、特異性強、敏感、穩定性強、不需要特殊設備和試劑、結果判斷直觀等優點，目前已開始應用于小分子物質的檢測，如毒素、藥殘、環境監測等領域，隨著膠金技術的逐步推廣，替代ELISA方法成為各檢測機構、廣大基層部門進行樣本大規模篩選的首選方法勢在必行。劉烜等建立用于快速檢測肉、魚、蝦等組織中QNs殘留的CGIA方法。采用免疫競爭法，將抗QNs單克隆抗體-膠體金復合物包被在膠體金結合墊上，并將人工合成的QNs抗原包被在硝酸纖維素薄膜表面作為檢測線(T線)，以顏色直觀顯示檢測的定性結果，靈敏度最低值可達到10ng/mL。Sheng等建立了檢測牛奶中OFL、MAR和FLE的CGIA方法，LOD為0.02～0.05ng/mL。

3)化學發光酶免疫法(chemiluminescenceenzyme-linkedimmunoassay，CLEIA)

CLEIA由化學發光分析系統和酶聯免疫反應系統兩部分構成。化學發光分析系統是指化學發光物質或者酶經催化氧化反應釋放大量自由基使之形成-一個不穩定的激發態中間體，待其恢復到穩定基態后，多余的能量以光子的形式發射出來，經發光信號測量儀器可檢測其發光強度。而酶聯免疫反應系統是指經催化反應參與發光的酶標記的生物活性物質(抗原或抗體)進行特異性抗原抗體免疫反應后，形成抗原抗體免疫反應復合物。然后根據測定的發光強度和催化反應參與發光的標記酶的關系進行定量分析。CLEIA具有設備儀器簡單、操作方便、靈敏度高、特異性強、專一性、線性動力學范圍廣、易實現自動化和不具有放射性污染諸多優點。李源珍等建立可同時檢測牛奶中OFL、MAR、FLE殘留的直接競爭化學發光酶免疫法(dc-CLEIA)，方法的LOD分別為0.01ng/mL、0.03ng/mL、0.04ng/mL。牛奶中的OFL、MAR、FLE用7.5%的三氯乙酸提取，200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL5個添加水平的平均回收率在75.4%～94.1%之間。張慧麗等建立了CLEIA法測定牛奶中ENR殘留，將牛奶樣品中的ENR與標記有堿性磷酸酶的ENR同時與限量的特異性固相ENR抗體進行競爭結合反應，通過分離未結合的標記抗原，測定標記抗原與抗體復合物化學發光強度，經相應的數學函數計算出待測抗原的含量，快速地測定牛奶中ENR殘留量，方法的LOD為239.9pg/mL，檢測范圍為350～1000pg/mL，批內與批間RSD均小于15%。

4)熒光偏振免疫分析法(fluorescence polarization immunoassay，FPIA)

FPIA與ELISA方法相比較，FPIA簡化了操作步驟且縮短了操作時間，把非均相的反應系統轉換為均相的反應系統，是一種簡單、可靠、快速和高效的免疫分析方法。Mi等建立了可同時檢測牛奶中5種QNs和雞肉中6種QNs殘留的單試劑FPIA方法。以最佳熒光標記物SAR-5-羧基熒光素與QNs廣譜識別性單克隆抗體制備了免疫復合物單試劑，所建立的單試劑FPIA靈敏度高且反應速度快，將樣品與單試劑充分混合后不需要進一步溫育便可直接檢測。本方法對CIP的LOD為0.75ng/mL，IC50為2.17ng/mL，檢測范圍為1.2～4.0ng/mL，該方法對牛奶中5種QNs的CCβ均小于15ng/mL，對雞肉中6種QNs的CCβ均小于50ng/mL，添加空內牛奶和雞肉樣本的平均回收率為77.8%～116%，CV低于17.4%。宋佩等以異硫氰酸熒光素(FITC)標記沙拉沙星(SAR)合成熒光標記物，采用薄層色譜法提純，優化了反應時間、標記物和抗體的工作濃度，建立了SAR的快速FPIA分析法。該方法測定SAR在緩沖液中的IC50為43.2ug/L，檢測范圍為5.7～327μg/L；同時考察了FPIA測定SAR的動力學過程及對其他4種QNs的交叉反應。結果表明CIP、ENR、DAT及OFL的交叉反應率分別為3.3%、1.8%、1.7%和0.7%；在牛奶和豬尿中SAR的回收率分別為71%～94%和74%～102%。

5)磁微粒酶聯免疫法(magnetic particle-based enzyme immunoassay，MPEIA)

MPEIA將磁微粒應用到ELISA中，取代傳統的酶標板固相載體，并利用磁性微珠在磁場下能夠進行分離的原理，磁微粒與單克隆抗體連接，即為免疫磁珠，與相對應的檢測抗原結合后，在磁場的作用下，特異結合的抗原與其他未反應物質分離，最后通過酶聯免疫顯色反應測定抗原含量。MPEIA克服了普通ELISA測定中的一些缺點，更具優越性。Zhang等制備了CIP的特異性單克隆抗體，建立了MPEIA法檢測雞肌肉中的CIP，在0.3～24.3ng/mL濃度范圍內，IC50和LOD分別為2.27ng/mL和0.25ng/mL。在雞肌肉中，CIP添加量為8ng/mL、20ng/mL和40ng/mL時，回收率均大于79%。建立的MPEIA分析法和ELISA呈現出極好的相關性。抗CIP單克隆抗體與8種QNs有著較高的交叉反應率：ENR(110.1%)、SAR(99.7%)、DIF(75.1%)、DAN(89.8%)、NOR(110.3%)、LOM(65.2%)、OFL(75.1%)和FLU(45.0%)。此方法具有分離簡單、反應均勻、檢測快速(30min內)和結果穩定等優點。

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