河豚魚、鰻魚及烤鰻中9種糖皮質激素殘留量測定分析條件的優化

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

10.2.1.7 分析條件的優化

(1) 提取凈化條件的優化

糖皮質激素藥物屬于脂溶性激素，在結構上都是環戊烷多氫菲衍生物，所以采用乙酸乙酯作為提取劑能夠有效地從河豚魚、鰻魚及烤鰻樣品提取此類藥物。在參考農業部1031號公告-2-2008方法基礎上，首先對樣品的提取步驟進行了實驗，在實驗中發現，稱取樣品后，先進行氫氧化鈉溶液的皂化步驟，然后用乙酸乙酯提取，雖然經過皂化后，提取的油脂相對較少，并且經過Cleanert Silica固相萃取柱的凈化后，潑尼松龍、潑尼松、氫化可的松、可的松、甲基潑尼松龍、倍他米松、地塞米松的回收率也令人滿意，但倍氯米松、醋酸氟氫可的松的回收率很低。先用乙酸乙酯提取一次后，再進行氫氧化鈉皂化，倍氯米松、醋酸氟氫可的松的回收率有所提高，但回收率仍然達不到60%，這說明氫氧化鈉的皂化步驟影響倍氯米松、醋酸氟氫可的松的提取。所以本方法在進行河豚魚、鰻魚及烤鰻樣品樣品的提取步驟時，減少了皂化步驟。在確定的方法中，稱取5g樣品后，加入15g無水硫酸鈉，以減少水分，分散魚肉組織和防止魚肉樣品在振蕩時產生結塊，加入25mL乙酸乙酯，用均質器均質1min，在振蕩器振蕩20min，以10000r/min離心10min，取.上清液至梨形瓶中。再用25mL提取一次，合并上清液，用旋轉蒸發器于45℃水浴上減壓蒸發至近干，用1mL乙酸乙酯和5mL正己烷溶解，待凈化。本方法對乙酸乙酯的提取效率也進行了實驗。在對添加了高濃度的糖皮質激素混合標準工作溶液的河豚魚肉樣品用乙酸乙酯提取二次后，再用25mL乙酸乙酯提取一次，按照本方法規定的操作步驟進行測定，未檢出糖皮質激素殘留。

在本方法的研究中，主要對Cleanert Silica固相萃取柱的凈化效果和洗脫效率進行了實驗。取500μL濃度為0.05μg/mL的糖皮質激素混合標準工作溶液，在氮氣吹干儀.上吹干，用1mL乙酸乙酯和5mL正己烷溶解，用移液器分三次移至已用6mL正已烷預處理的Cleanert Silica固相萃取柱中，分別三次收集流出物于10mL樣品管中；然后用3×2mL正己烷洗滌Cleanert Silica固相萃取柱，分三次將收集流出物于10mL樣品管中；再用3×2mL丙酮+正己烷(4+6)洗脫劑洗脫固相萃取柱，分三次收集流出物于10mL樣品管中；將九個樣品管用氮氣吹干儀吹干，分別用1mL 20%乙腈水溶解，液相色譜-串聯質譜儀測定。經過試驗發現，1mL乙酸乙酯和5mL正已烷，6mL正己烷均未將糖皮質激素洗脫下來，6mL丙酮+正己烷(4+6)可以將萃取柱.上的糖皮質激素洗脫下來。另外用乙酸乙酯和正己烷可將大部分油脂和干擾物洗脫下來。所以，Cleanert Silica固相萃取柱的凈化效果令人滿意。本方法也對OasisHLB固相萃取柱進行了實驗，對于河豚魚、鰻魚及烤鰻樣品的凈化，無論從操作步驟、洗脫條件和凈化效果都不如Cleanert Silica固相萃取柱。

(2)色譜和質譜條件的優化

本方法采用AB公司生產的3200 Q TRAP型號液相色譜-串聯質譜儀進行條件實驗。由于9種糖皮質激素化合物極性存在一定差異，所以采用梯度洗脫方法實現分離。由于潑尼松龍和可的松，倍他米松和地塞米松的母離子和子離子完全相同，在質譜上無法區分，所以必須通過色譜實現分離，另外，由于倍氯米松、醋酸氟氫可的松出峰較晚，并且靈敏度相對較低，這就要求流動相中乙腈和水的比例要達到即能達到倍氯米松、醋酸氟氫可的松分離，又要使倍氯米松、醋酸氟氫可的松的靈敏度達到要求，所以本方法最終采用的梯度洗脫程序見下表10-1。本方法經過優化梯度程序，實現了九種化合物的分離。

在ESI(-)模式下，糖皮質激素化合物形成[M-H+HCOOH]-形式的分子離子峰，通過碰撞處理，子離子掃描進一步得到定量和定性子離子碎片峰，進而采用MRM模式進行監測。本方法還對氣簾氣壓力，霧化氣壓力，輔助加熱氣壓力，去簇電壓，碰撞能量進行了優化，使方法靈敏度達到了檢測需要。

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