糖皮質激素類藥殘留分析技術測定方法——液相色譜-質譜法

時間：2023-03-25 02:59:18來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

糖皮質激素類藥殘留分析技術測定方法——液相色譜-質譜法

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

(4)液相色譜-質譜法(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)

在GCs殘留分析中，HPLC法難以區分互為差向異構體的地塞米松和倍他米松，而GC-MS雖然可以做定性分析，但是需要復雜的衍生化過程。隨著LC-MS技術的發展，已經成為檢測這類藥物的首選。主要采用電噴霧電離(ESI)和大氣壓化學電離(APCI)兩種電離方式。

1)APCI電離

Cherlet等建立了定量測定牛奶中地塞米松的LC-APCI-MS/MS檢測方法。10mL牛奶中加入20%三氯乙酸(w/v)，渦動混勻后離心，沃特曼濾紙過濾，C18固相萃取柱凈化，LC-MS/MS檢測。方法CCa和CCβ分別為0.48ng/mL和0.76ng/mL。該作者等還采用類似的技術建立了牛血漿和組織中地塞米松的測定方法。方法LOQ為：肌肉、腎0.375ng/g，肝1ng/g，血漿1ng/mL；LOD為：肌肉0.09ng/g，腎0.13ng/g，肝0.33ng/g。

2)ESI電離

A.單級質譜(LC-MS)

Pavlovic等報道了采用液相色譜-單級四極桿質譜(LC-MS)測定牛尿中皮質醇、可的松、潑尼松龍和潑尼松的方法。樣品過濾、酶解和SPE凈化后，進LC-MS分析。Restek UItra II Allure Biphenyl色譜柱分離，等度洗脫，在EST、SIM模式下，監測離子[M+COOHT-]-、[M-H+]-和[M-H+-CH2O]-，以氟米松為內標定量。方法RSD小于17%。Panderi等報道了采用ESI技術檢測綿羊血漿中地塞米松的LC-MS方法。使用65%甲醇-水溶液(含0.1%甲酸，v/v)作為流動相，流速0.30mL/min。在ESI正離子、SIM模式下檢測。方法線性范圍在6～1000ng/mL之間，日內、日間RSD均小于24.1%，方法LOD和LOQ分別為1ng/mL和6ng/mL。

B.串聯質譜(LC-MS/MS)

Chen等建立了牛、豬、羊可食組織中8種GCs的LC-MS/MS測定方法。樣品采用PLE提取，LC-MS/MS在ESI負離子模式下，采用選擇反應監測(SRM)測定。在0.5～6μg/kg添加濃度范圍內，方法回收率在70.1%～103.1%之間，LOQ在0.5～2μg/kg之間。Shao等建立了LC-MS/MS同時測定豬肉、豬肝、豬腎中16種GCs的殘留分析方法。經BEHC18色譜柱分離后，在ESI負離子模式下采用LC-MS/MS測定。16種藥物的線性范圍在1～250μg/L之間；LOQ在0.1～1.0μg/kg之間；在添加濃度0.4～2.0μg/kg范圍，回收率為81.0%～112.3%。Tolgyesi等建立了一種應用LC-MS/MS同時測定牛肌肉、肝臟和腎臟樣品中8種GCs殘留的方法。該作者首次應用LC-MS/MS測定了牛組織中甲潑尼松及其主要代謝物。研究表明，較強的樣品凈化效果能夠產生更加干凈的監測基線，可以在MS/MS檢測器中設置較高的電子倍增電壓(DeltaEMV)。EMV為500V時信號的響應得到了改善，但是噪聲水平沒有變化，因此，總體靈敏度和分析限得到了提高。在HPLC分離中，使用Kinetex phenyl-hexylcore-shell柱，使地塞米松和其β-差向異構體、β-米松在12min內被洗脫并能夠實現基線分離，進一步提高了靈敏度。每種基質中GCs的LOQ和LOD范圍分別為0.01～13.3μg/kg和0.01～0.1μg/kg。Dusi等建立了同時測定肝臟中9種GCs的LC-MS/MS方法。肝組織經酶解后萃取，OasisHLB固相萃取柱凈化，采用LC-MS/MS在ESI模式下，以氘標記內標物進行定量測定。分析樣品中濃度大約為1μg/kg的GCs均能被檢測到，所有待測物的回收率均高于62%，重復性和再現性分別均低于7.65%和15.5%。Deceuninck等采用UPLC-MS/MS技術建立了肝臟樣品中地塞米松、倍他米松、潑尼松龍和甲潑尼龍的殘留分析方法。通過選擇性較強的樣品前處理，結合UPLC-MS/MS高靈敏度測定系統，將地塞米松和倍他米松兩種異構體有效分離，可以定性和定量測定復雜生物基質中這4種GCs。結果表明，該方法具有較好的重復性，即使在非常低的濃度水平也能鑒定化合物。Tolgyesi等建立了豬脂肪中5種GCs(潑尼松龍、甲基強的松、氟米松、地塞米松和甲潑尼龍)的LC-MS/MS檢測方法。樣品用正己烷溶解，甲醇-水(50+50，v/v)提取，HLB柱凈化后，進LC-MS/MS分析。以pH5.4甲醇-乙酸緩沖液為流動相，Ascentis Express Fused-Coretype色譜柱分離，等度洗脫，7.5min內完成分離測定。方法平均回收率在81%～100%之間，室內重現性為8.0%～20.5%；具有限量化合物的CCa為4.5～11.9.ug/kg，禁用化合物為0.1～0.2ug/kg；方法LOD在0.1～0.3μg/kg之間。

Li等建立了同位素稀釋LC-ESI-MS/MS法，快速同時測定牛奶中的地塞米松和倍他米松。樣品直接用C18固相萃取柱凈化，洗脫液氮氣吹干，流動相溶解，采用Hypercarb色譜柱，以乙腈-水-甲酸溶液(95+5+0.5，v/v)為流動相，進行LC-MS/MS檢測，D-4地塞米松作為同位素內標進行定量分析。雖然地塞米松和倍他米松互為差向異構體，Hypercarb C18液相色譜柱很容易將它們快速分離，且峰形較好，在空白組織中未見干擾。研究還發現，GCs在ESI質譜中的準分子離子峰有[M+H]+、[M-H]-、[M+HCOO]-等多種形式。該方法選擇[M+HCOO]-作為準分子離子峰，并對質譜條件進行優化。優化后各離子對錐孔電壓均為25V，m/z437/361和m/z441/363兩離子對碰撞能量為20eV，m/z 437/307.4離子對碰撞能量為35eV。該方法用于牛奶中地塞米松和倍他米松的殘留檢測，單個樣品的總分析時間約35min。崔曉亮等建立了UPLC-MS/MS檢測牛奶中的12種GCs(潑尼松、潑尼松龍、可的松、氫化可的松、甲基強的松龍、地塞米松、倍氯米松、氟米松、醋酸氟氫可的松、布地耐德、曲安奈德、氟輕松)殘留的方法。牛奶試樣經甲醇提取，正己烷脫脂，SPE凈化，UPLC-MS/MS分析。色譜柱為C18柱(100mm×1.0mmi.d，1.7μm)，柱溫40℃，樣品溫度10℃，進樣體積2μL，流動相為0.1%甲酸溶液和甲醇，線性梯度洗脫，流速0.1mL/min；EST電離，毛細管電壓3.00kV，錐孔電壓45V，射頻透鏡1和2的電壓分別為27.0V和0.0V，離子源溫度99℃，脫溶劑溫度350℃，脫溶劑氣流量500L/h，碰撞梯度為2.0，多反應監測(MRM)模式檢測。該方法的LOD為0.02～0.38μg/kg，LOQ為0.07～1.27μg/kg，回收率為69.3%～94.3%，RSD為3.5%～16.7%。

Yang等利用LC-ESI-MS/MS檢測肌肉、牛奶和肝臟中的50種同化激素(包括曲安西龍、潑尼松、可的松、氫化可的松、潑尼松龍、氟米松、醋酸氟氫可的松、甲潑尼龍、倍氯米松、地塞米松、曲安奈德、氟輕松、布地奈德、丙酸氯倍他索等GCs)。樣品經芳基硫酸酯酶/葡糖醛酸糖苷酶于37℃過夜水解，甲醇提取，石墨化炭黑和氨基SPE柱凈化，LC-ESI-MSMS測定。方法LOQ為0.04～2.0μg/kg，平均回收率為76.9%～121.3%，CV為2.4%～21.2%。

童穎等建立了同時測定豬血漿中二丙酸倍他米松及其代謝物倍他米松的LC-MS/MS法。血漿樣品經酸化后以乙醚-環已烷(4+1，v/v)提取，LC-MS/MS分析。以HederaODS-2(150mm×2.1mm，5um)為分析柱，流動相為5mmol/L醋酸銨溶液(含0.1%乙酸)-甲醇，梯度洗脫。二丙酸倍他米松、倍他米松及內標布地奈德的監測離子對分別為m/z563.2([M+CH3COO]-)→483.1、m/z451.2([M+CH3COO]-)→361.0和m/z489.3([M+CH3COO]-)→357.1。二丙酸倍他米松血藥濃度在26.85～644.4ng/L范圍內線性關系良好，倍他米松血藥濃度在10.62～637.2ng/L范圍內線性關系良好。雍莉等建立了LC-MS/MS方法同時測定血漿中的腎上腺素、去甲腎上腺素、可的松和氫化可的松。樣品經乙腈沉淀蛋白和萃取后，15000r/min離心5min，取上清液進樣分析。ESI正離子檢測，MRM方式定量分析。腎.上腺素、去甲腎上腺素、可的松和氫化可的松在0.02～200.00ng/mL濃度范圍內線性良好，相關系數均大于0.999，LOD分別為4.13pg/mL、4.64pg/mL、4.29pg/mL和4.52pg/mL，日內和日間精密度分別為1.19%～5.42%和2.16%～6.04%，用于血漿樣品分析，加標回收率為80.0%～109.0%，樣品測定精密度為3.93%～7.57%。Leporati等采用LC-MS/MS開發了尿液中潑尼松龍及其4種代謝物的分析方法，LOD在0.35～0.42ng/mL之間。

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