糖皮質激素類藥殘留分析技術測定方法——高效液相色譜法

時間：2023-03-25 03:02:18來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

糖皮質激素類藥殘留分析技術測定方法——高效液相色譜法

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

(2)高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)

在HPLC檢測中，反相C18色譜柱是目前GCs分離最常用的液相色譜柱，而酸性流動相有助于改善峰形，通常采用甲醇或乙腈-甲酸溶液，甲酸的濃度通常采用0.1%～0.5%，也有采用乙酸銨溶液和三氟乙酸溶液的報道。GCs常用的檢測器主要有紫外檢測器(ultraviolet detector，UVD)、熒光檢測器(fluorescencedetector，FLD)和化學發光檢測器(electrochemical detector，CLD)等。

1)紫外檢測器(UVD)和二極管陣列檢測器(DAD/PDA)

UVD是HPLC方法中常用的檢測器。GCs在紫外(200～400nm)有強吸收，但在200nm處基質干擾嚴重；多數GCs有共軛雙鍵，在240nm有強吸收，基質干擾減少，采用最多。

Shearan等建立了牛組織中地塞米松的反相HPLC-UVD檢測方法。肌肉、腎臟和肝臟用乙酸乙酯提取，脂肪用乙醚提取，甲潑尼龍作為內標，C18固相萃取柱凈化后，用C18柱(250mm×4.6mm，5μm)分離，甲醇-水(70+30，v/v)為流動相，在254nm處檢測。地塞米松的LOD為0.01mg/kg。

Desi等建立了牛奶中地塞米松和潑尼松龍殘留檢測方法。采用MSPD提取和凈化，C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)分離，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為1mL/min，柱溫為40℃，進樣量為100uL，DAD在240nm檢測。地塞米松和潑尼松龍的LOD分別為0.075μg/kg和0.50μg/kg，回收率分別為52.9%～64.7%和59.0%～64.1%，RSD分別為3.0%～4.1%和2.9%～5.1%。

Grippa等建立了HPLC方法測定馬血清中的氫化可的松、地塞米松等藥物。用乙酸乙酯提取，氮氣吹干后，甲醇復溶，進HPLC分析。C18柱分離，流動相為乙腈-水(51+49，v/v，含0.1%三氟乙酸)，流速1mL/min，254nm處檢測，以丙磺舒為內標定量。方法LOQ為0.25μg/mL，批內和批間CV分別為3%～6%和9%～15%。Zhang等120)建立了檢測血漿和尿液中氫化可的松和潑尼松龍的HPLC-DAD方法。使用乙酸乙酯提取，Hypersil-ODS色譜柱(125mm×4.0mm，5.0μm)分離，流動相采用甲醇-水(60+40，v/v)，流速1mL/min，進樣量20μL，柱溫25℃，DAD在200～380nm檢測。方法的回收率為88.4%～104.4%；尿液中潑尼松龍的LOD和LOQ分別為1.7ng/mL和5.2ng/mL，氫化可的松的LOD和LOQ為0.8ng/mL和2.5ng/mL；血漿中潑尼松龍的LOD和LOQ分別為1.0ng/mL和3.0ng/mL。盛欣等建立了測定血液和尿液中倍他米松的HPLC-UVD法。以乙酸乙酯為萃取劑、潑尼松為內標。用C18柱(250mm×4.6mm，5μm)分離，甲醇-水(60+40，v/v)為流動相，檢測波長240nm測定。倍他米松在血液和尿液中的線性范圍為0.1～20μg/mL，r2大于0.999；LOD均為0.02μg/mL；平均回收率為91%～104%，日內、日間RSD小于4.6%。

2) 熒光檢測器(FLD)

FLD也是HPLC常用的一種檢測器。用紫外線照射色譜餾分，當試樣組分具有熒光性能時，即可檢出。FLD選擇性高，只對熒光物質有響應；靈敏度也高，最低檢出限可達10～12ug/mL，適合于各種熒光物質的痕量分析，也可用于檢測不發熒光但經化學反應后可發熒光的物質。Wu等建立了血漿中倍他米松和地塞米松的HPLC-FLD檢測方法。血漿經C18固相萃取柱凈化，洗脫液用離心蒸發器60℃蒸干，加入100μL 1-乙氧基-4-(二氯-S-三嗪基)萘(1.0mmol/L)溶解，再加入約50mg碳酸鉀，40℃水浴振蕩反應1h后，用C18色譜柱分離，乙腈-水(60+40，v/v)作為流動相，FLD檢測(激發波長360nm，發射波長410nm)。方法線性范圍在2.5～50.0pmol之間，LOQ為80.0fmol/20uL，回收率均優于90%。

3) 化學發光檢測器(CLD)

CLD的原理是某些物質在常溫下進行化學反應，生成處于激發態勢反應中間體或反應產物，當它們從激發態返回基態時，就發射出光子。由于物質激發態的能量是來自化學反應，故叫作化學發光，其光強度與該物質的濃度成正比。這種檢測器不需要光源，也不需要復雜的光學系統，只要有恒流泵，將化學發光試劑以一定的流速泵入混合器中，使之與柱流出物迅速而又均勻地混合，產生化學發光，通過光電倍增管將光信號變成電信號，就可進行檢測。CLD有設備簡單、價廉、線性范圍寬、快速、靈敏等優點。

Iglesias等建立了牛肝臟中地塞米松的HPLC-CLD檢測方法。采用氫氧化鈉溶液和乙酸乙酯提取組織樣品，離心后蒸干，乙腈復溶，正己烷脫脂，以乙腈-0.5mmol/L乙酸銨溶液(pH6.0，40+70，v/v)為流動相，C18色譜柱分離，發光氨作為化學發光試劑，CLD檢測。方法回收率高于80%，LOD達到0.2ppb。Zhang等建立了在線電解生成[Cu(HIO6)2]5-發光氨化學發光-HPLC法檢測豬肝臟中的7種GCs。基于GCs對[Cu(HIO6)2]5-發光氨的化學發光信號的增敏作用，流動注射在線電解生成[Cu(HIO6)2]5-發光氨，化學發光檢測GCs。采用Nucleosil RP-C18色譜柱(250mm×4.6mmi.d，5μm)分離，乙腈-1.0mmol/L乙酸銨溶液(pH6.8，40+60，v/v)為流動相，流速為8mL/min。在添加濃度5～50ng/g范圍，方法回收率在88%～106%之間，RSD為2.0%～6.9%。

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