糖皮質激素類藥殘留分析技術——前處理方法（二）

時間：2023-03-25 03:05:34來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

糖皮質激素類藥殘留分析技術——前處理方法（二）

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

(3)凈化方法

GCs的凈化通常采用液液分配(LLP)、沉淀、固相萃取(SPE)來完成，近年來也有使用免疫親和色譜(IAC)、基質固相分散(MSPD)以及QuEChERS等凈化技術的報道。

1)液液分配(liquid liquid partition，LLP)

樣品中的脂肪通常加入正已烷進行LLP去除。

李存等用乙腈提取豬肝臟中的地塞米松和倍他米松。在豬肝臟樣品中加入15mL乙腈，混勻后以4000r/min離心2min，收集提取液于50mL離心管中，在殘渣中加入10mL乙腈，勻質30s，以4000r/min離心2min，合并兩次提取液，加入10mL正已烷和4mL乙酸乙酯，渦旋混合1min后，以4000r/min離心2min，然后吸取中間層于50mL梨形瓶中，加入5mL正丙醇，在50℃水浴中旋轉濃縮至干，用1mL甲醇溶解殘渣，待全部殘渣溶解后加入10mL純水，混勻后C18固相萃取柱凈化，進行LC-MS/MS分析，同位素內標法定量分析。地塞米松和倍他米松的LOD分別為0.12μg/kg和0.14μg/kg，LOQ分別為0.42μg/kg和0.47μg/kg；在添加濃度0.75～2.0μg/kg范圍內，平均添加回收率為97.3%～111%。

李飛等用乙酸乙酯提取速凍調制肉制品中的GCs，正已烷LLP去除雜質，LC-MSMS測定。方法的LOD為0.2～1.0μg/kg，LOQ為0.5～2.0μg/kg，添加回收率范圍為85.0%～96.4%，RSD為2.3%～6.1%。

徐錦忠等用乙腈超聲提取雞肉和雞蛋中潑尼松、潑尼松龍、地塞米松、氟氫可的松、甲基潑尼松、倍氯米松及氫化可的松，正己烷LLP脫脂凈化后，進行LC-MS/MS分析。該方法的LOQ為0.5μg/kg；在0.5μg/kg、1.0μg/kg和5.0μg/kg濃度添加水平，平均回收率為73.4%～108.9%，RSD為3.4%～13.4%。

Zhang等采用LLP技術提取凈化血漿和尿液中的氫化可的松和潑尼松龍。1mL樣品中加入6mL乙酸乙酯，混勻，室溫靜置10min，1789g離心20min，收集乙酸乙酯層，水相再用1mL乙酸乙酯萃取1次，靜置，離心，合并乙酸乙酯層，40℃水浴氮氣吹干，250uL甲醇復溶，HPLC檢測。方法的回收率為88.4%～104.4%；尿液中潑尼松龍的LOD和LOQ分別為1.7ng/mL和5.2ng/mL，氫化可的松的LOD和LOQ為0.8ng/mL和2.5ng/mL；血漿中潑尼松龍的LOD和LOQ分別為1.0ng/mL和3.0ng/mL。

2)沉淀法(precipitation)

生物基質(如牛奶)中含有大量的蛋白質，會干擾GCs殘留分析，常采用試劑沉淀的方法來去除。通常加入氫氧化鈉、三氯乙酸、三氟乙酸等溶液脫蛋白。

李飛等用乙酸乙酯提取組織中的GCs，殘渣中加入0.1mol/L氫氧化鈉溶液10mL，混勻，再加乙酸乙酯20mL，渦旋混合，振動15min，8000r/min離心15min，移取乙酸乙酯層，合并兩次提取液，LC-MS/MS測定。方法的LOD為0.2～1.0μg/kg，LOQ為0.5～2.0μg/kg，添加回收率范圍為85.0%～96.4%，RSD為2.3%～6.1%。侯亞莉等在堿性條件下用乙酸乙酯提取牛肉中地塞米松、倍他米松和倍氯米松，正己烷LLP脫脂，固相萃取柱凈化后，進行LC-MS/MS分析。方法的LOD和LOQ為0.5μg/kg和2.0μg/kg；方法回收率在77.6%～97.9%之間，批內CV為2.5%～7.9%，批間CV為3.1%～8.7%。Iglesias等在牛肝中加入氫氧化鈉溶液，再用乙酸乙酯提取地塞米松，蒸干，乙腈復溶后，用正己烷LLP，再用HPLC測定。方法回收率80%以.上，LOD為0.2ppb，重現性為10.7%，重復性為6.2%～8.9%。

Caretti等用純水將5mL牛奶稀釋到20mL，加入300μL三氟乙酸酸化，渦動混勻1min，超聲5min，6000r/min離心10min，再用10mL 2%三氟乙酸溶液洗滌蛋白沉淀物2次，C18固相萃取柱凈化后用LC-MS/MS測定。13種GCs的回收率超過70%，日間RSD小于12%。Cherlet等向牛奶中加入三氯乙酸沉淀蛋白，過濾，再用固相萃取柱凈化，LC-MS/MS測定。地塞米松的LOQ為0.15ng/mL，LOD為41pg/mL；檢測限(CCa)和檢測能力(CCβ)分別為0.48ng/mL和0.76ng/mL；方法回收率高于56%。該作者采用類似的方法檢測牛血漿中的地塞米松，加入三氯乙酸沉淀蛋白后，用乙酸乙酯提取，LC-MS/MS測定，方法LOQ可以達到1ng/mL。

3)固相萃取(solid phase extraction，SPE)

GCs殘留凈化常用的SPE柱填料主要有C18、HLB、氨基、MCX和硅膠等。

李存等將豬肝提取液在50℃水浴中旋轉濃縮至干，用1mL甲醇溶解殘渣，待全部殘渣溶解后加入10mL純水，混勻后過C18固相萃取柱凈化，進行LC-MS/MS分析，內標法定量。地塞米松和倍他米松的LOD分別為0.12μg/kg和0.14μg/kg，LOQ分別為0.42μg/kg和0.47μg/kg；在添加濃度0.75～2.0μg/kg范圍內，平均添加回收率為97.3%～111%。該作者還開發了牛奶中地塞米松和倍他米松的殘留檢測方法。樣品直接過C18固相萃取柱富集凈化，洗脫后LC-MS/MS分析。技術指標滿足法規要求。VandenHauwe等用C18固相萃取柱凈化牛肝中的11種GCs，LC-MS/MS檢測。禁用GCs的CCa和CCβ在0.08～0.38μg/kg之間，倍他米松、地塞米松、強的松龍和甲基強的松龍在0.1～0.5μg/kg之間。

吳敏等采用SPE技術凈化豬肉中地塞米松、倍他米松和倍氯米松。在提取液中加入磷酸鹽緩沖溶液，在弱酸性條件下過HLB固相萃取柱，使待測物保持正離子態而被吸附在固相萃取柱上。依次用5mL水、磷酸鹽緩沖溶液、水淋洗，再用2mL二氯甲烷洗脫，LC-MS/MS檢測。方法回收率在83%～96%之間，地塞米松、倍他米松和倍氯米松的LOQ分別為1μg/kg、1μg/kg、2μg/kg。Hidalgo等建立了尿液中地塞米松的氣相色譜-質譜(GC-MS)檢測方法。樣品經酶解后，過HLB柱凈化，衍生化后，用GC-MS測定。該方法比較了HLB和C18固相萃取柱的凈化效果，發現HLB凈化效果好、回收率高，可以顯著降低基質的本底信號，方法LOD可以達到0.2ng/mL。鄒曉春等用乙酸鈉-乙酸緩沖溶液提取肉中5種GCs，再過HLB柱凈化，LC-MS/MS測定。平均加標回收率在86.2%～102.8%之間，RSD小于10.4%。

李飛等建立了速凍調制肉制品中GCs的殘留檢測方法。樣品經乙酸乙酯提取后，過硅膠SPE柱凈化，最后用乙腈定容，經LC-MS/MS測定。采用外標峰面積法進行定量，該方法的LOD分別為0.2ug/kg、0.5μg/kg、1.0ug/kg，LOQ分別為0.5ug/kg、1.0ug/kg、2.0μg/kg；添加回收率范圍為85.0%～96.4%，RSD為2.3%～6.1%。Mllinson等分析牛、豬和羊肝、肉中的地塞米松，樣品在氫氧化鈉存在的條件下用乙酸乙酯提取，離心，有機相過硅膠SPE柱凈化，再用HPLC測定。肝臟和肌肉的回收率分別大于70%和60%，LOD為1.4ppb。

侯亞莉等建立了牛肉中地塞米松、倍他米松和倍氯米松的殘留分析方法。樣品在堿性條件下經乙酸乙酯提取，正已烷LLP脫脂，通過MCX固相萃取柱凈化后，進行LC-MS/MS分析。方法的LOD和LOQ分別為0.5μg/kg和2.0μg/kg，三種藥物添加水平為0.5μg/kg、2μg/kg和50μg/kg時，方法的回收率在77.6%～97.9%之間。Salem等采用乙醚-環己烷提取血液中的倍他米松及其乙酸和磷酸酯，MCX固相萃取柱凈化后，LC-MS/MS測定。倍他米松的LOD為0.50ng/mL，其乙酸酯的LOD為1.00ng/mL，在2.0～200.0ng/mL范圍呈良好線性。

為了提高凈化效果，也有采取聯合用柱的方式進行凈化。

Shao等建立同時測定豬肉、豬肝、豬腎中16種GCs的殘留分析方法。酶解液首先用石墨化碳黑(ENVI-Carb)柱凈化，然后再用氨基柱進一步凈化，LC-MS/MS測定。16種藥物的線性范圍在1～250μg/L之間，LOQ在0.1～1.0μg/kg之間，在添加濃度0.4～2.0μg/kg的回收率為81.0%～112.3%。Kaklamanos等聯合使用HLB和氨基SPE柱凈化肌肉組織中的GCs。肌肉組織經水解，甲基叔丁基醚提取，正已烷脫脂，氮氣吹干，甲醇-水(1+9，v/v)復溶，OasisHLB凈化，HLB柱用3mL甲醇活化和3mL平衡，上樣后用3mL含5%甲醇的2%氨水溶液(v/v)，3mL含40%甲醇的2%氨水溶液(v/v)和3mL水分別洗滌，3mL丙酮-甲醇(80+20，v/v)洗脫，洗脫液直接通過已用3mL丙酮-甲醇(80+20，v/v)預淋洗的氨基柱，收集流出液，于55℃水浴中氮氣吹干，加入600μL甲醇復溶，再于55℃水浴中氮氣吹干后，加入100μL甲醇復溶，LC-MS/MS檢測。方法的CCa和CCβ分別為0.03～0.14ng/g和0.05～0.24ng/g。崔曉亮等聯合使用HLB、硅膠、氨基SPE柱凈化牛奶中的12種GCs。試樣經甲醇提取，正已烷脫脂，SPE凈化。HLB柱依次用6mL甲醇、6mL水活化后，將試樣溶液過柱，先用6mL水淋洗，再用6mL甲醇洗脫；洗脫液用氮氣吹干后，加入3mL正已烷溶解，過硅膠柱，用6mL正己烷淋洗，再用6mL水飽和的乙酸乙酯洗脫；洗脫液用氮氣吹干后，加入3mL甲醇～乙酸乙酯(40+60，v/v)溶解，過氨基柱，收集流出液，再用3mL甲醇-乙酸乙酯(40+60，v/v)洗脫，合并流出液，用氮氣吹干，加入甲醇溶解，用LC-MS/MS測定。該法的LOD為0.02～0.38μg/kg，LOQ為0.07～1.27μg/kg；回收率為69.3%～94.3%，RSD為3.5%～16.7%。

4)免疫親和色譜(immunafinity chromatography，IAC)

IAC以抗原抗體的特異性、可逆性免疫結合反應為基礎，當含有待測組分的樣品通過IAC柱時，固定抗體選擇性地結合待測物，其他不被識別的樣品雜質則不受阻礙地流出IAC柱，經洗滌除去雜質后將抗原-抗體復合物解離，待測物被洗脫，樣品得到凈化。其優點在于對目標化合物的高效、高選擇性保留能力，特別適用于復雜樣品痕量組分的凈化與富集。Bagnati等報道了采用IAC提取牛尿中地塞米松和倍他米松的檢測方法。以含地塞米松抗體的硅膠填料裝柱，制備IAC柱，連入HPLC系統，用作在線提取和凈化。尿液直接進樣，收集HPLC凈化后的組分，經濃縮、N，O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)衍生化后，采用GC-MS測定。方法LOD為：地塞米松0.1ng/mL，倍他米松0.2ng/mL。牛晉陽等建立了豬肉中GCs多殘留分析方法。樣品經甲醇提取，IAC柱凈化后，采用LC-MS/MS檢測分析。在低、中、高3種質量濃度加標回收率均為78%～101%，LOD為0.2～2μg/kg。

5)基質固相分散萃取(matrix solid phase dispersion，MSPD)

MSPD是將樣品與填料一起混合研磨，使樣品均勻分散于固定相顆粒表面，制成半固態后裝柱，然后根據“相似相溶”原理選擇合適的洗脫劑洗脫。該技術濃縮了傳統樣品前處理中勻漿、組織細胞裂解、提取、凈化等多個過程，避免了待測物在這些過程中的損失，提取凈化效率高、耗時短、節省溶劑、樣品用量少，但研磨的粒度大小和填裝技術的差別會使淋洗曲線有所差異，不易標準化。Desi等報道了采用MSPD技術凈化牛奶中地塞米松和氫化波尼松殘留的方法。研究比較了C18、C8、C4、C2、Phenyl等填料的凈化效果，發現C2填料凈化后共萃取的脂肪較少，且過柱速度更快，將提取、凈化、濃縮合為一步，簡化和加快了樣品前處理步驟。該方法取4g的C2吸附劑，用5mL甲醇沖洗2次后與10g牛奶樣品充分混合，加入3mL乙腈再次充分混合，靜置5min，加入8mL水混合，抽干，20mL水洗滌，真空抽干5min后，連在弗羅里硅土SPE柱(用5mL正已烷和10mL乙腈平衡)上面，用20mL乙腈洗脫，洗脫液于55℃下氮氣吹干，2mL乙腈復溶，1mL正己烷液液萃取3次，乙腈層氮氣吹干后，用250μuL流動相復溶，HPLC檢測。地塞米松和氫化波尼松的LOD分別為0.075μg/kg和0.50μg/kg，回收率分別為52.9%～64.7%和59.0%～64.1%，RSD分別為3.0%～4.1%和2.9%～5.1%。

6)QuEChERS (Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe)

QuEChERS是近年來國際上最新發展起來的一種用于農產品檢測的快速樣品前處理技術。其原理與HPLC和SPE相似，都是利用吸附劑填料與基質中的雜質相互作用，吸附雜質從而達到除雜凈化的目的。連英杰等建立雞肉中4種GCs多殘留的QuEChERS/超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)同時測定方法。稱取5.00g雞肉樣品于50mL離心管中，加入10mL乙酸乙酯，均質1min，再加入pH12氫氧化鈉緩沖液5mL，渦旋1min，4000r/min離心5min，收集.上清液移入50mL離心管，試樣殘渣中再加入10mL乙酸乙酯均質離心重復提取一次，合并上清液。離心管中加入0.6g分散劑(PSA50mg，bulk carbograph 7.5mg，C18EC 50mg，硫酸鎂50mg)，渦旋2min凈化，4000r/min離心5min，取上層液體過有機濾膜，采用UPLC-MS/MS檢測。4種藥物在相應的濃度范圍內線性良好，相關系數均大于0.991；在3個加標水平下的平均回收率為84.4%～94.1%，RSD為7.5%～12.5%；LOD和LOQ分別為0.37～9.55μg/kg及1.11～28.65μg/kg。

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