液相色譜-串聯質譜法測定河豚魚、鰻魚和烤鰻中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚殘留

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

9.2.3.1 適用范圍

適用于河豚魚、鰻魚及烤鰻中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚殘留量的液相色譜-串聯質譜測定。方法檢出限：均為1.0μg/kg。

9.2.3.2 方法原理

河豚魚、鰻魚及烤鰻中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚殘留，用叔丁基甲基醚和乙酸鹽緩沖液加酶解劑提取試，經硅膠柱凈化，用液相色譜-串聯質譜儀測定，內標法定量。

9.2.3.3 試劑和材料

叔丁基甲基醚、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷：色譜純；乙酸、氫氧化鈉：優級純；乙酸鈉(CH3COONa·3H2O)分析純。

3mol/L氫氧化鈉溶液：稱取120g氫氧化鈉溶于1000mL去離子水中；0.2mol/L乙酸鹽緩沖液(pH=5.2)：稱取2.52g乙酸和12.95g乙酸鈉溶解于800mL水中，用氫氧化鈉溶液調節pH至5.2±0.1，加水定容至1000mL；溶解液：正已烷-二氯甲烷(3+2，v/v)；淋洗液：乙酸乙酯-正己烷(3+47，v/v)；洗脫液：乙酸乙酯-正己烷(3+2，v/v)。

β-葡糖苷酸酶/硫酸酯復合酶：含β-葡糖苷酸酶124400units/mL，硫酸酯酶3610units/mL。

激素及代謝物標準物質：玉米赤霉醇(包括a-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇，各50%)純度≥97%；玉米赤霉酮，純度≥97%；己烯雌酚，純度≥99%；己烷雌酚，純度≥98%；雙烯雌酚，純度≥98%。

標準溶液：分別準確稱取適量的玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、雙烯雌酚和己烷雌酚標準物質，用甲醇配制成1mg/mL標準貯備溶液。再根據需要以甲醇配制成不同濃度的混合標準溶液作為標準工作溶液，保存于4℃冰箱中。

內標標準物質：a-玉米赤霉烯醇-4氘代，純度≥99%；己烯雌酚-8氘代，純度≥98%。

內標標準溶液：準確稱取適量a-玉米赤霉烯醇-4氘代和己烯雌酚-8氘代標準物質，用甲醇分別配制成1mg/mL標準貯備溶液。再以甲醇稀釋成適用濃度的混合內標工作溶液，保存于4℃冰箱中。

硅膠固相萃取柱：500mg，3mL。

9.2.3.4儀器

液相色譜-串聯質譜聯用儀：配有電噴霧電離源；分析天平：感量0.1mg和0.01g；自動固相萃取儀或固相萃取裝置；高速均質器：轉速大于10000r/min；氮氣吹干儀；烘箱：控溫精度±1℃；渦旋振蕩器；離心機：轉速大于3000r/min；pH計：測量精度±0.3pH單位；具塞離心管：25mL，50mL；微量注射器：100μL。

9.2.3.5 樣品前處理

(1) 試樣制備

取有代表性樣品500g，絞碎后攪拌均勻，制成實驗室樣品。試樣分為兩份，置于樣品盒中，密封，并做上標記。將試樣于-18℃下保存。

(2) 樣品稱取

稱取5個陰性樣品，每個樣品為5g(精確到0.1g)，將上述樣品置于50mL離心管中分別加入適量混合標準工作溶液，使各被測組分玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烷雌酚、已烯雌酚和雙烯雌酚的濃度分別為2.5ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL。再分別加入適量內標標準工作溶液，使其濃度均為10ng/mL。

(3) 提取

加入20mL叔丁基甲基醚，在10000r/min均質1min。3000r/min離心5min，將上清液全部轉移至另一50mL具塞離心管中備用。離心管中的殘渣置于通風櫥中揮發30min，加入15mL乙酸鹽緩沖液，高速均質1min，3000r/min離心5min，將上清液全部轉移至另一25mL具塞試管中，并在氮吹儀上于40℃水浴中吹去殘余叔丁基甲基醚后，加入80μL β-葡糖苷酸酶混勻，于52℃烘箱中放置過夜。在此緩沖溶液中加入氫氧化鈉溶液將溶液pH調至7，加入10mL叔丁基甲基醚，充分混合，3000r/min離心2min。移取叔丁基甲基醚層與前述的叔丁基甲基醚提取液混合，在氮吹儀上于40℃水浴中吹干。加入1mL溶解液，渦旋30s溶解，待凈化。

(4) 凈化

固相萃取凈化條件：用6mL正己烷分兩次預洗硅膠柱，流速均為4mL/min。上樣，流速為2mL/min，在樣品試管中加入3mL淋洗液，混合后過柱，流速為2mL/min，用3mL淋洗液以3mL/min的速度淋洗，加入2mL空氣以4mL/min的速度吹過硅膠柱。用6mL洗脫液洗脫，流速為2mL/min，加入2mL空氣以6mL/min的速度吹過硅膠柱，收集洗脫液。將洗脫液在氮吹儀上于40℃水浴中吹干，加入1mL流動相，渦旋30s溶解。溶液過0.2μm濾膜后，供液相色譜-串聯質譜測定。

(5) 實測樣品溶液的制備

稱取待測樣品5g(精確到0.1g)于50mL離心管中，加入內標工作溶液，使其最終定容濃度均為10ng/mL。按上述步驟操作。

(6) 空白基質溶液的制備

稱取陰性樣品5g(精確到0.1g)于50mL離心管中，按上述步驟操作。

(7) 基質標準工作溶液

將標準工作溶液及內標標準工作溶液混合后在氮吹儀中吹干，以基質提取液溶解，渦旋30s后即為基質標準工作溶液。

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