牛豬肝腎和肌肉組織中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚殘留測定分析條件的選擇

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

9.2.1.7 分析條件的選擇

(1)被測物的提取

本方法試驗了用乙酸乙酯和叔丁基甲基醚(MTBE)進行提取，其結(jié)果見表9-5。由表9-5可見，乙醚和MTBE提取玉米赤霉醇和玉米赤霉酮的效率相當，而對于二苯乙烯類激素則MTBE作為提取溶劑回收率較好，因而最終選取MTBE作為提取溶劑。

表9-5 不同溶劑提取對回收率的影響

動物源性樣品中玉米赤霉醇和二苯乙烯類激素以兩種形式存在，即游離態(tài)和與蛋白結(jié)合態(tài)，加入β-葡糖苷酸酶可使結(jié)合態(tài)的玉米赤霉醇和二苯乙烯類激素水解成游離態(tài)。本實驗在基質(zhì)中添加結(jié)合了單葡萄糖醛酸的己烯雌酚標準物質(zhì)，模擬比較酶解前后己烯雌酚的回收率，結(jié)果表明酶解后回收率提高30%以上，因而在實際樣品測定中酶解是必不可少的步驟。本方法采用兩步提取:先用MTBE提取樣品中游離態(tài)的組分，轉(zhuǎn)移出MTBE后，將樣品殘渣中殘余MTBE除凈，將乙酸鹽緩沖液中加入殘渣后，加入酶解劑水解，中和后用MTBE抽提，這樣可保證游離態(tài)的和與蛋白結(jié)合態(tài)的玉米赤霉醇和二苯乙烯類激素都能有效提取。

(2)固相萃取凈化

LC-MS/MS具有較高的檢測靈敏度，但復雜的基質(zhì)背景會抑制目標化合物的離子化效率，大大降低被測組分的檢測靈敏度，而且樣品凈化程度對結(jié)果重現(xiàn)性也有很大的影響。本方法采用硅膠柱進行SPE凈化處理，比較了不同牌號的硅膠柱，發(fā)現(xiàn)美國J.T.Baker公司Bakerbond SPE Sillica Gel(SiOH) Column (500mg)回收率相對較高，因而最終選擇用Bakerbond SPE硅膠柱。

本方法檢測的5種類雌激素及代謝物要求限量低，基質(zhì)復雜，因此考慮應(yīng)用自動固相萃取儀(AS PE)減少人為因素誤差，提高重現(xiàn)性。對淋洗液比例、洗脫液比例、洗脫液用量各項參數(shù)進行優(yōu)化,結(jié)果見表9-6至表9-8。

表9-6 淋洗液比例對回收率的影響(淋洗液用量6mL)

表9-7 洗脫液比例對回收率的影響(先用乙酸乙酯-正己烷[6+94]淋洗，再行洗脫)

表 9-8 洗脫液用量對回收率的影響(分三次洗脫，每次用量3mL)

實驗檢測的目標物為兩類，玉米赤霉醇及代謝物和二苯乙烯類激素。兩類物質(zhì)性質(zhì)上存在差別，因而在確定最終實驗條件時需兼顧兩類物質(zhì)。由表9-7可見，淋洗液比例只能選用乙酸乙酯-正已烷(6+94，v/v)，6mL。由表9-8實驗結(jié)果得出，應(yīng)用乙酸乙酯-正己烷(60+40，v/v)洗脫液可得到全部目標物較高的回收率。由表9-9實驗結(jié)果得出，應(yīng)用6mL洗脫液能將待測物洗脫約90%，再增加洗脫液用量回收率沒有明顯提高，但吹干時間將延長。最終確定了本實驗淋洗液比例、洗脫液比例、洗脫液用量各項參數(shù)。

(3) 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用注射泵直接進樣方式，以5μL/min將玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚和雙烯雌酚的標準溶液分別注入串聯(lián)質(zhì)譜的離子源中。一級質(zhì)譜分析(Q1，母離子掃描)比較了電噴霧電離(ESI)的正方式和負方式，5種被測物均在負方式條件下得到了較高的響應(yīng)值，確定了準分子離子峰[M-1]，優(yōu)化了去簇電壓(DP)。對被測物的準分子離子碰撞后，進行二級質(zhì)譜分析(MS2，子離子掃描)，得到子離子質(zhì)譜圖，見圖9-3。

圖9-3 五種化合物二級質(zhì)譜圖

對每種被測物選定的子離子進行碰撞氣能量(CE)的優(yōu)化。在連接了液相色譜儀后，嘗試采用大氣壓化學電離(APCI)負方式進行測定，發(fā)現(xiàn)APCI(-)電離方式檢測靈敏度更高些。通過對APCI(-)條件下離子源溫度、霧化氣壓力、氣簾氣壓力、輔助氣1壓力、噴霧器電流等參數(shù)優(yōu)化，確定了本方法最終分析參數(shù)。以優(yōu)化后本方法提供的參數(shù)對被測物進行檢測，玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烷雌酚的方法最低檢出限可達0.25μg/kg，己烯雌酚和雙烯雌酚的方法檢出限為0.5μg/kg，可滿足日常檢測和殘留監(jiān)控要求。

(4)HPLC條件的優(yōu)化

本方法先后試用了Waters公司、Agilent公司、Merck公司等多個品牌的C18和C8柱，經(jīng)比較Agilent公司的ZORBAX SB C8(150mm×4.6mm，3.5μm)對玉米赤霉醇和二苯乙烯類激素的分析柱效更好一些。

采用APCI電離時，乙腈為首選流動相，流速1mL/min。在此前提下試驗了不同流動相比例和梯度程序。由于流速較高，乙腈比例不宜低，最終選定乙腈-水=70+30。對比了不同梯度洗脫程序的分離結(jié)果，沒有明顯改善，因而選定了固定比例流動相。

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