液相色譜-串聯質譜法測定牛豬肝腎和肌肉組織中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚殘留

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

9.2.1.1 適用范圍

牛豬肝腎和肌肉組織中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、已烷雌酚、雙烯雌酚殘留量的液相色譜-串聯質譜測定。方法檢出限：牛豬肝腎和肌肉組織中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烷雌酚為0.5μg/kg；己烯雌酚和雙烯雌酚為1.0μg/kg。

9.2.1.2 方法原理

試樣中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚殘留，用叔丁基甲基醚和乙酸鹽緩沖溶液加酶解劑分別提取，硅膠固相萃取柱凈化后濃縮，用液相色譜-串聯質譜儀測定，保留時間和離子豐度比定性，內標法定量。

9.2.1.3試劑和材料

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正已烷、二氯甲烷、叔丁基甲基醚：色譜純；乙酸、乙酸鈉(CH3COONa：3H2O)：優級純。

乙酸鹽緩沖溶液：0.2mol/L，pH=5.2。稱取2.72g乙酸和12.95g乙酸鈉溶解于800mL水中，用氫氧化鈉溶液調節pH至5.2±0.1，加水定容至1000mL。

氫氧化鈉：優級純；氫氧化鈉溶液：3mol/L。稱取120g氫氧化鈉溶于1000mL去離子水中；

溶解液：正己烷+二氯甲烷(60+40，v/v)。量取60mL正已烷與40mL二氯甲烷混合。

淋洗液：乙酸乙酯+正已烷(6+94，v/v)。量取6mL乙酸乙酯與94mL正己烷混合。

洗脫液：乙酸乙酯-正己烷(60+40，v/v)。量取60mL乙酸乙酯與40mL正己烷混合。

β-葡糖苷酸酶：H-2型，含β-葡糖苷酸酶124400unit/mL，硫酸酯酶3610units/mL。

激素及代謝物標準物質：玉米赤霉醇(包括a-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇，各50%)、玉米赤霉酮：純度≥97%；己烯雌酚，純度≥99%；己烷雌酚、雙烯雌酚：純度≥98%。

激素及代謝物標準溶液：分別準確稱取適量的玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、雙烯雌酚和己烷雌酚標準物質，用甲醇配制成1.0mg/mL標準儲備溶液。再根據需要以甲醇配制成不同濃度的混合標準溶液作為標準工作溶液，保存于4℃冰箱中，可使用3個月。

內標標準物質：氘代玉米赤霉醇(包括a-玉米赤霉醇-4氘代和β-玉米赤霉醇-4氘代，各50%)，純度≥99%；己烯雌酚-8氘代，純度≥98%。

內標標準溶液：準確稱取適量玉米赤霉醇-4氘代和己烯雌酚-8氘代標準物質，用甲醇分別配制成1.0mg/mL內標標準儲備溶液。再以甲醇稀釋成與5ng/mL玉米赤酶醇和己烯雌酚峰面積或峰高相當濃度的混合內標標準工作溶液，保存于4℃冰箱中，可使用3個月。

硅膠固相萃取柱：500mg，3mL。使用前用6mL正己烷分兩次預洗硅膠柱，流速均為4mL/min。

9.2.1.4 儀器和設備

液相色譜-串聯質譜聯用儀：配有大氣壓化學電離源；分析天平：感量0.1mg和0.01g；自動固相萃取儀或固相萃取裝置；高速均質器：轉速大于10000r/min；氮氣濃縮儀；渦旋振蕩器；離心機：轉速大于3000r/min；pH計：測量精度±0.2pH單位；具塞試管：25mL，50mL；微量注射器：25μL，100μL。

9.2.1.5 樣品前處理.

(1) 樣品制備

取有代表性樣品500g，絞碎后攪拌均勻，制成實驗室樣品。試樣分為兩份，置于樣品盒中，密封，并做上標記。制備好的試樣置于-18℃冰柜保存。

(2)試樣稱取

稱取5個陰性樣品，每個樣品為5g(精確到0.01g)，置于50mL離心管中，分別加入不同量混合標準工作溶液，使玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烷雌酚的濃度為1.25ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL；己烯雌酚和雙烯雌酚的濃度為2.5ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL。再分別加入適量內標標準工作溶液，使內標物濃度均為10ng/mL。

(3)提取

加入20mL叔丁基甲基醚，在10000r/min轉速下高速均質1min。3000r/min離心5min，將上清液全部轉移至另一50mL具塞試管中備用。離心管中的殘渣置于通風櫥中揮發30min，加入15mL乙酸鹽緩沖液，高速均質1min，3000r/min離心5min，將上清液全部轉移至另一25mL具塞試管中，并在氮氣濃縮儀上于40℃水浴中吹去殘余叔丁基甲基醚后，加入80μL β-葡糖苷酸酶混勻，于52℃烘箱中放置過夜。在此緩沖溶液中加入氫氧化鈉溶液將溶液pH值調至7，加入10mL叔丁基甲基醚，充分混合，3000r/min離心2min。移取叔丁基甲基醚層與前述的叔丁基甲基醚提取液混合，在氮氣濃縮儀上于40℃水浴中吹干。加入1mL溶解液，渦旋30s溶解，待凈化。

(4)凈化

把樣液轉入硅膠固相萃取柱，流速為2mL/min，在樣品試管中加入3mL淋洗液，混合后過柱，流速為2mL/min，用3mL淋洗液以3mL/min的速度淋洗，加入2mL空氣以4mL/min的速度吹過硅膠柱。用6mL洗脫液洗脫，流速為2mL/min，加入2mL空氣以6mL/min的速度吹過硅膠柱，收集洗脫液。將洗脫液在氮氣濃縮儀上于40℃水浴中吹干，加入1mL流動相，渦旋30s溶解。溶液經濾膜過濾后，供液相色譜-串聯質譜測定。

(5)試樣溶液的制備.

稱取待測樣品5g(精確到0.01g)于50mL離心管中，加入內標標準工作溶液，使內標物含量均為2.0μg/kg，按上述步驟操作。

(6)空白基質溶液的制備

稱取陰性樣品5g(精確到0.01g)于50mL棕色離心管中，按上述步驟操作。

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