非甾類同化激素類藥殘留量測定方法（五）

時間：2023-03-25 03:30:46來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

非甾類同化激素類藥殘留量測定方法（五）

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

(8)免疫分析法(immunoassay，IA)

免疫分析方法以抗原抗體的特異性反應為基礎，以高特異性、高靈敏度著稱，可使分析過程簡化，適用于復雜基質中痕量組分的分析。主要有化學發光酶免疫法(CLEIA)、放射免疫法(RIA)、放射受體分析法(RRA)、酶聯免疫吸附法(ELISA)、時間分辨熒光免疫(TRFIA)和免疫傳感器等。

1)化學發光酶免疫法(chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA)

CLEIA是用參與某一化學發光反應的酶如辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)或堿性磷酸酶(alkaline phosphate，ALP)來標記抗原或抗體，在與待測樣品中相應的抗原(抗體)發生反應后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標記抗體復合物，經洗滌后，加入底物(發光劑)，酶催化和分解底物發光，由光量子閱讀系統接收，光電倍增管將光信號轉變為電信號并加以放大，再把他們傳送至計算機數據處理系統，計算出待測物的濃度。

Zhu等建立了牛奶和尿液中ZER的CLEIA檢測方法。5mL樣品中加入15μL β-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶于37℃酶解16h，勻漿3min，加入10mL乙腈，3500r/min離心10min，上清液于40℃水浴中氮氣吹干，10mL純水復溶，MAXSPE柱凈化，4mL甲酸-甲醇溶液(5+95，v/v)洗脫，40℃水浴中氮氣吹干，1mL磷酸緩沖液復溶。在微量板中加入100μL ZER-雞卵清白蛋白(OVA)碳酸鹽緩沖液(1：5000)，4℃包被16h，洗滌3次，37℃封閉1h(150μL每孔)，洗滌3次，加入50uL抗ZER抗體(1：800000)，37℃封閉30min，洗滌5次，加入100μL化學發光底物液，酶標儀檢測。方法的LOD為50ng/L，回收率為84.7%～123.6%。Jiang等開發了牛組織中ZER及其代謝物的CLEIA檢測方法。模擬分析物半抗原與小牛血清蛋白(BSA)結合，免疫獲得單克隆抗體，該抗體對ZAN具有很高的交叉反應性。該方法的LOD為0.05μg/kg；回收率超過75%，CV小于15%。

2)放射免疫分析法(radioimmunoassav，RIA)

RIA是利用同位素標記的與未標記的抗原同抗體發生競爭性抑制反應，反應后分離并測量放射性而求得未標記抗原的量。自20世紀70年代被首次用于檢測動物尿液中DES殘留以來，RIA被廣泛.地用于動物肌肉肝臟、尿液、牛奶中DES殘留檢測及DES在動物組織中代謝規律的研究上。

vanPeteghem等用RIA測定肉中DES殘留。樣品經酶水解，乙醚提取，過SPE柱凈化后，RIA測定。LOD達0.07ng/g，回收率為64%～115%。Oeeffe等取小母牛頸部肌肉進行RIA分析檢測DES。樣品粗提物經C18柱純化，DES的LOD可達40pg/g。Gaspar等用反相C18柱抽提和純化尿液，對22份未經添加DES的動物尿液和76份已知不同添加濃度的動物尿液進行RIA分析。未經處理的樣品DES測量值平均為0.07ng/mL；添加值1ng/mL時，添加樣本所測值與實際值相關系數為0.982。Stitch等認為尿液中存在一種與DES結構相似的酚類化合物，這被作為尿液檢測中假陽性出現比較高的-種解釋。RIA與其他技術聯合，如HPLC-RIA、Celite-RIA可以有效地去除樣品中雜質對DES檢測的干擾、富集待測DES、提高檢測靈敏度。

3)放射受體分析法(radio receptor assay，RRA)

RRA是以受體蛋白作為特異性聯結劑，測定待測物(配體)的一種競爭性放射分析法。受體是細胞內的一-種蛋白質，它能與配體特異結合，且有高度親和力。它與RIA的分析原理基本相似，不同的是，RIA法是通過抗體與分析物結合，而RRA是通過受體與分析物結合。Arts等用RRA法測定小牛尿液中DES，LOD可達0.6ng/mL。他們給小牛注射50mgDES，然后用RRA法測定尿液，發現在用DES處理后第9天仍然可以在尿液中檢測出，與同時用ELISA檢測的結果近似。

4)酶聯免疫分析法(enzyme-link immunosorbent assay，ELISA)

ELISA是采用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產生顏色反應，用于定量測定，靈敏度高，操作安全，不需要昂貴的儀器，可以滿足大批量快速測定的需求。

Goldstein等用ELISA測定動物組織、細胞、亞細胞中DES含量，檢測靈敏度是10ng/mL，與同時用RIA測定的結果相近

Sawaya等對綿羊尿液和雞肉做添加試驗，尿液的添加值為0.5～5ng/mL，用乙酸鈉緩沖液稀釋尿液，再經C18柱純化，ELISA法測得綿羊尿液中DES的回收率為90%～106%；雞肉的添加值為0.2～1.5ng/mL，樣本經叔丁基甲基醚反復抽提，C18柱純化，測得雞肉中DES的回收率為49%～68%。Li等27建立了雞和蝦組織中DES的ELISA檢測方法。雞和蝦組織經乙腈-丙酮溶液(4+1，v/v)提取，三氯甲烷脫脂，ELISA檢測。該方法的LOD為600pg/mL，回收率大于79.5%，日內、日間CV低于6%。

王鶴佳等建立了牛尿中ZER殘留的ELISA檢測方法。牛尿樣品6000r/min離心10min，上清液過0.45μm濾膜，取0.5mL，加入3mL 50mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.8)；加入8μL β-葡糖醛酸酶/芳基酯酶，37℃孵育3h，C18柱凈化，用3mL甲醇和2mL 50mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.8)分別平衡C18柱，加入0.5mL樣品，2mL 50mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.8)和3mL 40%甲醇洗滌C18柱，正壓吹干，1mL 80%甲醇洗脫，氮氣吹干，用0.5mL稀釋液溶解殘留物，取50μL用于ELISA檢測。方法的LOD為0.6ng/mL，50%抑制濃度(IC50)為3.0ng/mL；以10ng/mL、21ng/mL和35ng/mL濃度添加空白牛尿，回收率在70.0%～116.0%之間，CV在6.0%～15.%之間。賀艷等建立了ELISA法檢測牛肉中ZER殘留，在1g牛肉樣品中加入2mL去離子水和8μL葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，37℃水浴酶解2h，8mL乙腈振蕩10min，3000g以上離心5min，取上清5mL加入2mL三氯甲烷和6mL正已烷，渦動振蕩10min，3000g以上離心5min，去除上層正己烷，取中間層吹干后復溶，ELISA分析。方法的LOD為1.0μg/kg，添加回收率在72.4%～98.6%之間。Ana等采用ELISA方法篩查牛尿中的ZON。分析了50份樣品，除了4周歲小牛樣品外，均為陽性，最大濃度為241.1ng/mL。

5)時間分辨熒光免疫分析法(time-resolvedfluoroimmunoassay，TRFIA)

TRFIA是一種非同位素免疫分析技術，它用鑭系元素標記抗原或抗體，根據鑭系元素螯合物的發光特點，用時間分辨技術測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數進行信號分辨，通過時間延遲，去除非特異性熒光干擾，在固定時間檢測特異性熒光，解決了自然背景干擾問題，極大地提高了分析靈敏度。Du等利用生物素鏈親和素放大系統建立了DES的TRFIA分析方法。銪(Eu)標記的抗生蛋白鏈菌素衍生物與銪和二亞乙基三胺五乙酸酸酐偶聯作為標記抗生蛋白鏈菌素，與生物素結合的羊抗鼠IgG作為免疫測定中銷標記的抗生蛋白鏈菌素與抗DES抗體之間的電橋，通過測定Eu+水楊酸(SA)在615nm熒光強度定量測定DES。該方法的線性范圍廣(0.001～1000.0ng/mL)，檢測血清中DES的LOD為0.81pg/mL，回收率為97.4%～107.8%，CV為1.32%-4.04%。

6)免疫傳感器(immunosensor，IS)

免疫傳感器法是將高靈敏的傳感技術與特異性免疫反應結合起來，用以監測抗原抗體反應的生物傳感器，具備了免疫分析的高選擇性又兼有電化學分析的高靈敏性，易于實現殘留檢測儀器的便攜化、微型化和自動化，具有快速、靈敏、選擇性高、操作簡便等特點。Liu等建立了基于中空二氧化硅-納米金-多壁碳納米管(MSN-GNPs-MWCNTs)復合材料和辣根過氧化物酶抗體-普魯士藍-多壁碳納米管(HRP-Ab-GNPs-PB-MWCNTs)檢測牛奶中DES的電化學免疫傳感器法。MSN-GNPs-MWCNTs復合材料作為固定基質可以增強電極的電活性和穩定性，HRP-Ab-GNPs-PB-MWCNTs作為標記物用來改進電極的催化活性。方法的LOD為0.12ng/mL，回收率為92%～107%。王傳現等建立了電化學免疫傳感器法檢測動物組織和奶粉樣品中的DES。將納米金(AuNP)修飾在電極.上，然后將石墨烯(Gr)-殼聚糖(CS)復合物飾于玻碳電極表面，通過循環伏安法對修飾的電極進行表征。以[Fe(CN)6] 3-/4-為氧化-還原探針，基于DES抗原抗體反應引起[Fe(CN)6]3-/4-探針的電流響應的變化，來實現對DES的檢測。DES的質量濃度在0.5～1500.0ng/mL范圍，與峰電流呈良好的線性關系，相關系數為0.985，LOD為0.1ng/mL。檢測豬肉、牛肉、鴨肉和奶粉中DES的回收率分別為71.2%～117.7%、80.5%～110.1%、80.8%～117.8%和72.3%～117.2%。

Feng等采用納米多孔PtCo合金作為抗體的載體制備免疫傳感器，將ZER抗體偶聯到玻碳電極，結果發現無酶的米多孔PtCo合金免疫傳感器對抗原抗體反應具有極強的點催化活性，檢測牛尿中的ZER的檢測限為13pg/mL。Feng等又將納米蒙脫石轉化為鈉蒙脫石(Na-Mont)，用于硫堇(TH)、辣根過氧化物酶(HRP)和次級抗ZER抗體(Ab2)的固化。修飾后的微粒(Na-Mont-TH-HRP-Ab2)被用作免疫傳感器檢測ZER的標記物。采用固定有一級抗體(Ab1)，表面用玻碳電極(GCE)修飾的納米多孔金膜(NPG)制備免疫傳感器。在0.01～12ng/mL濃度范圍，ZER的相關系數r為0.9996；LOD為3pg/mL。

百檢網就是一家權威的食品檢測機構，提供各種檢測需求服務，有任何疑問歡迎電聯或者在線咨詢客服。

上一篇：非甾類同化激素類藥殘留量測定方法（四）

下一篇：液相色譜-串聯質譜法測定牛豬肝腎和肌肉組織中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚殘留