非甾類同化激素類藥殘留量測定方法（二）

時間：2023-03-25 03:35:30來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

非甾類同化激素類藥殘留量測定方法（二）

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

(5)高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)

HPLC是殘留分析的國際公認方法，選擇性強、靈敏度高。但是，因為樣品前處理步驟較多，操作繁瑣，分析時間長，不宜于殘留檢測的快速篩選。近年來，在HPLC基礎上發展起來的超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)，是基于小顆粒填料的一種創新技術，它同時實現了高分離度、高靈敏度和高分析速度，目前也已經應用于非甾類同化激素的殘留分析。非甾類同化激素HPLC檢測主要采用紫外檢測器(ultraviolet detector，UVD)、二極管陣列檢測器(diode-array detector，DAD；photo-diode array detector，PDA)、熒光檢測器(fluorescence detector，FLD)、蒸發光散射檢測器(evaporative light scattering detector，ELSD)以及電化學檢測器(electrochemical detector，ECD)等。

1)UVD，DAD/PDA

UVD是HPLC方法中常用的檢測器。非甾類同化激素的分子結構中含有酚羥基和碳碳雙鍵、酮基及酚羥基組成的長共軛體系，可以溶于稀堿溶液，在240～300nm有較強的UV吸收。

劉宏程等建立了HPLC-UVD法分析牛奶中DES、HES和DIS。采用MSPD技術提取和凈化，以20mmol/L磷酸-乙腈(42+58，v/v)為流動相，在Xterra C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱上分離；或者，以20mmol/L磷酸-乙腈(60+40，v/v)為流動相，在HypersilC18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱上分離；流速1.0mL/min，柱溫30℃，進樣20μL，紫外波長230nm檢測。3種雌激素的平均回收率為84.1%～93.5%，RSD為3.5%～7.8%；DES、HES和DIS的LOD分別為0.004mg/kg、0.004mg/kg和0.006mg/kg，LOQ分別為0.01mg/kg、0.01mg/kg和0.02mg/kg。

張清杰等采用HPLC-UVD法檢測牛奶和奶粉中的ZER、TAL、ZAN、ZON、ax-ZOL和β-ZOL。樣品用乙腈提取，IAC柱凈化，HPLC-UVD檢測。色譜柱為Cloversil-C18(4.6mm×250mm)，流動相為乙腈～甲醇-水(43+7+50，v/v)，流速為0.80mL/min，柱溫為室溫，波長為265nm，進樣量為20μL。牛奶和奶粉中ZER、TAL、ZAN、ZON、a-ZOL和β-ZOL的添加回收率均為80%～110%，CV均小于12%；牛奶的LOD為2.0μg/L，奶粉的LOD為0.4μg/kg。方曉明等建立了HPLC-UVD測定雞肝中ZER的方法。樣品經β-葡糖苷酸酶水解，乙醚提取，氫氧化鈉抽提，C18固相萃取柱凈化后，用Zorbax SB-Pheny1柱(250mm×416mmi.d.，5μm)分離，以乙腈-0.3%三氟乙酸水溶液(40+60，v/v)為流動相，流速為0.80mL/min，柱溫為室溫，進樣量為10μL，262nm波長處檢測。方法平均回收率為72.0%～80.4%，CV為8.3%～13.9%，LOQ為5μg/kg。

Koole等報道了采用HPLC-DAD同時測定牛尿中20種同化激素(包括二苯乙烯類和RALs)的分析方法。用RP-Select B色譜柱分離，乙腈-水為流動相，梯度洗脫，乙腈比例按照凹形曲線由43%上升到76%，各藥物獲得良好分離。以標準溶液校正的保留時間和UV光譜圖定性，降低了標準偏差原始值的約25%。方法LOD在5～10ng之間。

2)FLD

FLD具有較強的選擇性和較高的靈敏度，是殘留分析中常采用的檢測器。DES等二苯乙烯類需要衍生化才可以用FLD檢測，文獻報道很少；RALs中只有ZON、a-ZOL、β-ZOL可以用FLD檢測。

Chen等等采用4-(4，5-diphenyl-1Himidazol-2-yl)benzoyl chloride (DIB-Cl)為衍生化試劑，建立了尿液中DES的HPLC-FLD檢測方法。0.5mL尿液樣品中加入0.05mL濃鹽酸，80℃水解60min，待室溫后加入200mL 3mol/L NaOH中和，C18柱凈化，3mL乙酸乙酯洗脫，40℃水浴中氮氣吹干，200uL乙酸乙酯復溶，再加入200μL 2.5mmol/L DIB-CI乙腈溶液和3μL 3mol/L三乙胺乙腈溶液于40℃衍生化30min，用20μL 1mol/L hCl溶液終止反應，取20μL hPLC分析。C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)分離，流動相為甲醇-水(96+4，v/v)，流速為1.0mL/min，采用程序熒光檢測：0～8.5min，激發波長(λex)為200nm、發射波長(λem)為300nm；8.5～20min，λex為350nm、λem為460nm。結果，DES的LOD為0.5ng/mL，回收率為78.5%～88.3%，CV低于6.4%。

Shin等建立了HPLC-FLD方法檢測老鼠血清中的ZON。血清樣品經叔丁基甲基醚提取，HPLC-FLD分析，以為乙腈-0.1%三乙胺溶液(pH6，50+50，v/v)為流動相，在C18色譜柱(250mm×4.6mmi.d，5μm)上分離，λex和λem分別為246nm和460nm。該方法回收率為79.3%～96.2%，日內和日間CV低于12.1%，LOQ為10ng/mL。

3)ELSD

ELSD是一種通用型的檢測器，可檢測揮發性低于流動相的任何樣品，而無需發色基團。ELSD的響應值與樣品的質量成正比，因而能用于測定樣品的純度或者檢測未知物。ELSD靈敏度比示差折光檢測器高，對溫度變化不敏感，基線穩定，適合于HPLC梯度洗脫。

江勇等建立了HPLC-ELSD檢測肉產品中DES等藥物的殘留分析方法。稱取樣品5g于具塞三角瓶中，加甲醇10.0mL，超聲處理10min，取上清液離心后用HPLC-ELSD分析。經試驗確定HPLC和ELSD的條件：色譜柱Diamonsil TM C18 ODS(250mm×4.6mm.i.d，5um)，流動相為5%乙酸和乙腈，梯度洗脫，流速1.0mL/min，進樣量10μL，柱溫30℃；ELSD增益值為7，溫度40℃，載氣為空氣，壓力3.4bar。按信噪比(S/N)為3計算，該方法DES的LOD為0.0058mg/kg，回收率為85.2%，CV為3.18%。

4)ECD

ECD是測量物質的電信號變化。具有氧化還原性質的化合物，如含硝基、氨基等有機化合物以及無機陰、陽離子等物質，均可采用ECD檢測。ECD又包括極譜、庫侖、安培和電導檢測器等，前三種統稱為伏安檢測器，用于具有氧化還原性質化合物的檢測，而電導檢測器主要用于離子檢測。

Reuvers等用HPLC-ECD檢測動物可食用組織中的DES殘留。組織樣品先用叔丁基甲醚提取，1mol/L氫氧化鈉再次提取，用C18固相萃取柱凈化，以甲醇-0.05mol/L磷酸緩沖液(pH3.5)(67+33，v/v)為流動相，在Nucleosil C18色譜柱分離，ECD在+0.90V檢測。該方法LOD為0.5～2.0μg/kg，回收率為66%。萬美梅等建立了動物組織中DES的HPLC-ECD檢測方法。色譜柱為Hypersil ODS C18柱(5um，4.6mm×250mm)，流動相為乙腈-0.007mol/L磷酸二氫銨(48+52，v/v，pH3.5)，柱溫為32℃，流速為1.0mL/min。ECD參數設置：模式為前處理(pretreat)，工作電位0.9V，前處理控制設為停止，零點控制設為準備，后時間30min，前處理循環8次，前處理電位1為1.4V，前處理電位2為-0.4V，前處理時間1為200ms，前處理時間2為300ms，前處理時間3為500ms，峰寬0.10min，電極為氧化電極，儀器靈敏度0.5μA。DES濃度在0.2～100ng/g范圍內具有良好線性關系，相關系數為0.9995；各組織不同添加濃度的平均回收率均為80%，日內CV小于3.60%，日間CV小于3.72%；LOD為0.2ng/g。

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