液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛肝和牛肉中睪酮、表睪酮、孕酮殘留量

時間：2023-03-25 04:42:54來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛肝和牛肉中睪酮、表睪酮、孕酮殘留量

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

8.2.1.1 適用范圍

適用于牛肝和牛肉中睪酮、表睪酮、孕酮殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。方法檢出限：肝臟中睪酮、表睪酮、孕酮為0.5mg/kg，肌肉中睪酮、表睪酮為0.1mg/kg，孕酮為0.5mg/kg。

8.2.1.2 方法原理

牛肝和牛肉中的睪酮、表睪酮、孕酮藥物殘留經(jīng)酶解后用甲醇叔丁基甲醚提取，提取液用C18固相萃取柱凈化，肝臟樣品需再經(jīng)硅膠固相萃取柱凈化，洗脫液濃縮定容后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

8.2.1.3 試劑和材料

乙腈、甲醇、叔丁基甲醚、正已烷：色譜純；三氯甲烷、甲酸銨：分析純。

β-葡糖苷酸酶/硫酸酯酶：H-2型，Helixpomatia。磷酸鹽緩沖液：1.0mol/L。稱取13.6g磷酸二氫鉀溶于100mL水中，稱取8.7g磷酸氫二鉀溶于50mL水中，分別取70mL磷酸二氫鉀水溶液和28mL磷酸氫二鉀水溶液，混勻后調(diào)節(jié)pH為5.0，置4℃中可保存1周。飽和氯化鈉水溶液。水飽和乙酸乙酯。

睪酮、表睪酮、孕酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度≥99%。氘代睪酮(d5-睪酮)、氘代孕酮(d9-孕酮)內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度≥98%。

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：100μg/mL。準(zhǔn)確稱取適量的睪酮、表睪酮、孕酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇分別配制成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，-18℃貯存，可使用6個月。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：5μg/mL。分別吸取5mL睪酮、表睪酮、孕酮標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液至100mL容量瓶中，以甲醇稀釋并定容，此標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度為5μg/mL。-18℃貯存，可使用6個月。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：50ug/L。分別吸取1.00mL睪酮、表睪酮、孕酮標(biāo)準(zhǔn)工作液至100mL容量瓶中，以甲醇稀釋并定容，此混合工作溶液的濃度為50μg/L。-18℃貯存，可使用3個月。

內(nèi)標(biāo)儲備溶液：100μg/mL。準(zhǔn)確稱取適量的氘代睪酮(ds-睪酮)、氘代孕酮(d9-孕酮)標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別配制成100μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備溶液，-18℃貯存，可使用6個月。

內(nèi)標(biāo)工作溶液：5μg/mL。分別吸取5mL氘代睪酮(d5-睪酮)、氘代孕酮(d9-孕酮)內(nèi)標(biāo)儲備溶液至100mL容量瓶中，以甲醇稀釋并定容。-18℃貯存，可使用6個月。

內(nèi)標(biāo)混合工作溶液：25μg/L。分別吸取0.50mL氘代睪酮(d5-睪酮)、氘代孕酮(d9-孕酮)內(nèi)標(biāo)工作溶液至100mL容量瓶中，以甲醇稀釋并定容。-18℃貯存，可使用3個月。

基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：根據(jù)每種標(biāo)準(zhǔn)的靈敏度和儀器線性范圍，吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和內(nèi)標(biāo)工作溶液，用空白樣品提取液配成系列濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。當(dāng)天配制。

C18固相萃取柱：500mg，6mL。使用前依次用6mL甲醇、6mL水活化。硅膠固相萃取柱：200mg，6mL。使用前用6mL正已烷活化。

8.2.1.4 儀器和設(shè)備

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源；分析天平：感量0.1mg和0.01g；勻質(zhì)機；高速組織勻漿機；低溫高速離心機：轉(zhuǎn)速大于4000r/min；高速離心機：轉(zhuǎn)速大于12000r/min；超聲波；旋渦振蕩器；振蕩水浴；氮氣濃縮儀；固相萃取裝置；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；KD濃縮瓶。

8.2.1.5 樣品前處理

(1)試樣制備

取樣品約500g用組織搗碎機搗碎，裝入潔凈容器作為試樣，密封，并標(biāo)明標(biāo)記。將試樣于-18℃保存。

(2)酶解

準(zhǔn)確稱取5g試樣，準(zhǔn)確至0.01g，置于50mL離心管中，依次加入200μL內(nèi)標(biāo)混合工作溶液、10mL磷酸緩沖液，以14000r/min均質(zhì)30s，加入60μL葡萄糖苷酸酶/硫酸酯酶，混勻30s，置于37℃恒溫振蕩水浴中酶解16h。

(3)提取

酶解后的樣品溶液加10mL甲醇，混勻2min，置冰浴中放置5min，在5℃以4000r/min離心10min，上清液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，下層沉淀再用5mL甲醇重復(fù)上述操作一次，合并上清液至上述50mL離心管中，向離心管中加入15mL叔丁基甲醚，振搖5min，以4000r/min離心5min，上層溶液轉(zhuǎn)移至125mL分液漏斗中，下層溶液依次再用15mL、10mL叔丁基甲醚提取二次，合并上層溶液至上述分液漏斗中，加入10mL飽和氯化鈉水溶液，振搖30s，靜置分層，上層溶液轉(zhuǎn)移至梨形瓶中，在40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，殘渣中加入1.5mL甲醇，渦旋1min，超聲5min，再加入20mL水，混勻，待凈化。

(4)凈化

將樣品提取液轉(zhuǎn)移至已活化的C18固相萃取柱上，用5mL水洗滌梨形瓶，洗滌液合并至C18固相萃取柱中，以≤2mL/min流速使樣液通過固相萃取柱，待樣液過柱后，用5mL水淋洗C18固相萃取柱，棄去淋洗液，用10mL甲醇將待測組分從C18固相萃取柱.上洗脫，洗脫液轉(zhuǎn)移至梨形瓶中，在40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。肌肉樣品用0.5mL甲醇溶解殘渣，渦旋1min，加入0.5mL水混勻，過0.2um濾膜，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定。

肝臟樣品的洗脫液蒸干后，向梨形瓶中加入0.5mL三氯甲烷，渦旋1min，加入5mL正己烷，超聲1min，然后轉(zhuǎn)移至已活化的硅膠固相萃取柱中，以1mL/min流速使樣液通過固相萃取柱，待樣液過柱后，用5mL正己烷淋洗硅膠固相萃取柱，棄去淋洗液，用6mL水飽和乙酸乙酯洗脫待測組分，洗脫液轉(zhuǎn)移至KD接收瓶中，在40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加0.5mL甲醇，渦旋1min，加入0.5mL水混勻，過0.2um濾膜，供液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜測定。

稱取陰性樣品，按上述提取凈化步驟制備空白樣品提取液，用于配制系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

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