甾類同化激素類藥物殘留分析技術測定方法（五）

時間：2023-03-25 04:46:44來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

甾類同化激素類藥物殘留分析技術測定方法（五）

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

(6)免疫分析法(immunoassay，IA)

免疫分析法實際上是一種以抗體或抗原為分析試劑的特殊分析方法。免疫分析法包括酶聯免疫分析法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)和膠體金免疫層析分析法(GICA)，這三種方法具有特異性強、靈敏度高(可達10-12 g)、操作簡單等優點，逐漸成為ASs殘留初篩的常用方法。然而，也存在其產生的分析信號反差較高、靈敏試劑弱以及假陽性結果出現率偏高等缺點。

1)放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)

RIA是利用被測定的抗原物質和其標記物(標記抗原)同特異性抗體之間存在著競爭性的結合的放射性同位素體外微量分析方法，由于對人體具有放射性危害而較少應用。徐美奕等應用RIA法檢測了養殖與野生軍曹魚肌肉中生長激素及雌二醇、孕酮、睪酮等3種ASs的殘留量。通過預實驗確定魚肉激素提取液加入量為藥盒建議量的2倍。在放免試管中分別加入GH、E2、P、T標準抗原或待測的魚肉激素提取液、125I標記抗原、抗體，在37℃下的溫育時間分別為2.5h、1.5h、0.5h和1h，待免疫反應達到平衡后，4℃下離心(3600r/min)20min，棄去.上清液，用計數器分別測量各反應管沉淀物的放射性計數(cpm)，用SPSS統計軟件繪制劑量反應曲線，計算待測魚肉中的ASs殘留量。養殖軍曹魚中3種ASs殘留量分別為50.92×10-12、2.08×10-9、0.44×10-9，野生軍曹魚中3種ASs殘留量分別為29.78×10-12、1.28×10-9、0.08×10-9。

2)酶聯免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)

ELISA利用抗原抗體之間專--性嵌合特性，對檢體進行檢測。由于結合于固體承載物(一般為塑膠孔盤)上之抗原或抗體仍可具有免疫活性，因此設計其嵌合機制后，配合酵素呈色反應，即可顯示特定抗原或抗體是否存在，并可利用呈色之深淺進行定量分析。根據待測樣品與嵌合機制的不同，ELISA可設計出各種不同類型的檢測方式，主要以夾心法(sandwich)、間接法(indirect)以及競爭法(competitive)三種為主，具有靈敏度高、特異性好，操作簡便等特點，但是存在很難實現多殘留分析，存在交叉污染，容易出現假陽性等缺點。夾心法主要用來測大分子物質，而獸藥作為-一種小分子物質，夾心法很少使用。本章主要介紹間接競爭ELISA法和直接競爭ELISA法。

A.間接競爭ELISA法

Peng等建立了-種檢測豬肉中醋酸甲羥孕酮的間接競爭ELISA檢測方法。采用碳化二亞胺和混合酸酐法將藥物與牛血清白蛋白(BSA)，免疫獲得抗體。該方法LOD為0.096ng/g，可食組織的回收率范圍為72%～91%，工作濃度范圍為0.1～8.1ng/g。郭金花也開發了醋酸甲羥孕酮的ELISA試劑盒。將肟化后的醋酸甲羥孕酮分別與BSA和卵血清蛋白(OVA)通過混合酸酐法交聯，制備免疫抗原MPA-BSA和包被抗原MPA-OVA。以該免疫原免疫兔子后獲得的抗血清為基礎設計了間接競爭ELISA法。IC50為4.95ng/mL，線性范圍為0～100ng/mL，LOD范圍為0.1～0.3ng/mL，批內CV小于15%，批間CV小于20%。Jiang等采用間接競爭ELISA檢測牛尿中19-去甲睪酮殘留。該方法將藥物與半抗原偶聯免疫BALB/c小鼠獲得雜交瘤細胞，獲得mAbs親和力為2.6×109～4.7×109，滴度為0.64×105～2.56×105，IC50為0.55～1.0ng/mL。樣品用10%甲醇作為稀釋液，進行20倍稀釋。建立的間接競爭ELISA檢測方法的檢測范圍是0.004～85.8ng/mL，LOD是0.002ng/mL，IC50為0.55ng/mL。劉劍波等應用間接競爭ELISA法測定了醋酸甲羥孕酮在動物源可食組織中的殘留量，并采用GC-MS方法加以確證。比較GC-MS確證方法與ELISA方法所得結果，兩者的檢測結果相關性良好。

B.直接競爭ELISA法

Jiang等還建立了一種檢測牛可食性組織中19-去甲睪酮的直接競爭酶聯免疫吸附試驗方法(dcELISA)方法。通過細胞融合過程產生高特異性的單克隆抗體(mAbs)，并且建立了基于mAbs的異源性直接競爭ELISA法。方法工作濃度范圍是0.004～19ng/mL，IC50和LOD分別為0.28ng/mL、0.002ng/mL(0.01mol/L磷酸鹽緩沖液中，pH7.4)。與β-勃地酮交叉反應率為6.9%，與群勃龍交叉反應率為1.2%。實測樣檢測時直接競爭ELISA方法與GC-MS相關系數分別為0.9918(牛肉)、0.9834(牛肝)、0.9976(牛腎)。Sawaya等應用直接ELISA方法檢測了羊尿液和雞肉中的雌激素含量。用GC-MS方法檢測雌激殘留，結果為陰性，為了確證其殘留限度，再用ELISA方法進行檢測。ELISA試劑盒購自德國R-BiopharmgmbH公司。炔雌醇在尿液中含量范圍為0～0.9ppb，在雞肉組織中含量范圍為0～0.3ppb。研究發現，0.3ppb作為ELISA臨界點來判定樣品的陰性或陽性較為合理。所有樣品經GC-MS確證分析都為陰性，此結果表明基質對于ELISA檢測存在一定的影響。

3)膠體金免疫層析分析法(colloidal gold immunochromatographic assay，GICA)

GICA是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術。膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩定的膠體狀態。膠體金在弱堿環境下帶負電荷，可與蛋白質分子(抗體)等的正電荷基團形成牢固的結合。根據膠體金結合物的免疫學特性，因而廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。GICA具有成本低，不需要特殊的儀器設備，使用方便快速，便于基層使用和現場使用的優點，現已開始在殘留篩查中使用。

劉麗強研制了用于檢測19-去甲睪酮殘留的競爭性膠體金免疫層析試紙條。檢測線和質控線分別用金標點樣儀噴涂0.5mg/mL的19-去甲睪酮-OVA包被抗原和0.2mg/mL的羊抗兔IgG二抗。檢測添加19-去甲舉酮的豬尿樣本時，LOD為200ng/mL，通過使用Imag J 軟件對試紙條進行定量分析，可以得到的LOD為25ng/mL。Jiang等建立了檢測牛肉和豬肉中19-去甲睪酮的膠體金免疫分析方法。采用改良碳二亞胺法合成人工抗原(見圖8-7)，免疫BALB/c小鼠獲得mAbs。膠體金試紙條在PBS中LOD為1ng/mL，牛肉和豬肉中LOD均為2ug/kg，結果可在10min內讀出。田壯建立了膠體金快速檢測技術，確保能對19-去甲基睪酮進行準確、快速、高靈敏度的檢測。選擇用20nm左右的膠體金納米粒子標記19-去甲睪酮抗體，標記pH為8.6，標記濃度為7.2ug(抗體)/mL(金)，最終LOD可達到5ng/mL。

圖8-7 采用EDC法合成19-去甲睪酮人工抗原方法

Wei等建立了炔諾酮的膠體金檢測方法。應用了帶有氨基功能基團的中空硅膠顆粒，可用于固定金顆粒，再連接辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗用來檢測炔諾酮抗原，LOD可以達到3.58pg/mL，重復性、穩定性、靈敏度均較好。

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