動物源食品中硝基呋喃類代謝物殘留量測定分析條件的選擇和優化

[db:作者] / 2022-12-12 00:00

7.2.1.7 分析條件的選擇和優化

(1) 衍生化條件的選擇

本方法用2-NBA和4-NBA兩種衍生劑，對比了陽性樣品中AOZ、AMOZ、SEM和AHD殘留的衍生化效果，結果發現，2-NBA比4-NBA靈敏度高。因此，選擇2-NBA作為衍生劑。還對比了不同衍生劑用量對測定結果的影響。用靈敏度最低的AHD標準溶液，分別加入衍生劑0.05mg，0.1mg，0.2mg，0.5mg，1.0mg，5.0mg，10mg進行測定，響應值和衍生劑用量的關系結果見表7-6。

表7-6 衍生劑用量對測定結果(響應信號峰面積)的影響

從表7-5中看出，衍生劑加入量少于1.0mg，可能使被測物衍生不完全，若用量多于1.0mg，則在氮氣吹干時，會有衍生劑結晶物，不易被流動相溶解，測定時有干擾。選擇衍生劑用量為1.0mg。另外，實驗對比了衍生溶液不同pH對測定結果的影響。陽性樣品水解衍生后，加入3mL 0.1mol/L K2HPO4緩沖溶液，用NaOH溶液調到不同pH。不同pH時四種代謝物的測定響應值見表7-5。從表7-7可看出，衍生溶液pH在7.0～7.5之間時，四種代謝物的測定響應值最高，本方法選pH為7.4。

表7-7 不同pH四種硝基呋喃代謝物的響應信號(峰面積)

(2)凈化條件的選擇

實驗了兩種樣品凈化方式，一是衍生溶液調pH后用乙酸乙酯提取兩次，離心合并乙酸乙酯層氮氣吹干定容。這種方式提取效率較好，但是操作步驟比較繁瑣，乙酸乙酯層不能全部取出。有時還出現乙酸乙酯和水相分層不徹底的情況，易產生干擾，從而影響結果準確性。二是采用固相萃取柱凈化，比較了OasisMax (60mg，3mL Waters)，OasisHLB(60mg，3mL Waters)，OasisHLB(500mg，3mL Waters)，H2O-Philic DVB(60mg，3mL，Speedisk)，C18(500mg，3mL，J.T.Baker)和EN(200mg，3mL，MERCK)六種固相萃取柱的提取效率和凈化效果，結果見表7-8。從結果表明，OasisHLB(60mg，3mL Waters)，OasisHLB(500mg，3mL Waters)，和EN(200mg，3mL，MERCK)柱的提取效率和凈化效果都較理想，操作步驟比較簡單，適合于大批量樣品檢測。進一步的比較表明，OasisHLB(60mg，3mL Waters)柱的重現性比EN(200mg，3mL，MERCK)柱好。同時，考慮到OasisHLB(500mg，3mL Waters)柱成本較高，因此，選擇OasisHLB(60mg，3mL Waters)萃取柱作為樣品凈化柱。

表7-8 不同萃取柱四種硝基呋喃代謝物的響應信號(峰面積)

(3)液相色譜條件的選擇

1)豬肉、牛肉、雞肉、豬肝、魚類、蝦蟹類和貝類樣品

比較了Pinnacle II C18，5um，150mm×2.1mm；Inertsil ODS-3，5um，150mm×2.1mm，ZORBAX SB-C18，3.5μm，150mm×2.1mm和Atlantis-C18，3μm，150mm×2.1mm四種液相分析柱對四種硝基呋喃代謝物的分離效果，結果發現，Atlantis-C18分析柱，靈敏度和分離度都較理想。因此，選擇該柱為分析柱。

為了優化流動相，對比了甲醇+乙酸水溶液、乙腈+乙酸水溶液作流動相的色譜效果，實驗表明，乙腈+0.3%乙酸水溶液作為流動相并采用梯度洗脫時，四種代謝物的衍生物分離度和靈敏度較高。流動相梯度洗脫條件見表7-2。

2)牛奶或奶粉樣品

比較了Inertsil ODS-3，5um，150mm×2.1mm，ZORBAXSB-C18，3.5um，150mm×2.1mm和Atlantis-C18，3um，150mm×2.1mm三種液相分析柱對四種硝基呋喃代謝物的分離效果，結果發現，Atlantis-C18分析柱，靈敏度和分離度都較理想。因此，選擇該柱為分析柱。

為了優化流動相，對比了甲醇+甲酸水溶液、乙腈+甲酸水溶液做流動相的色譜效果，實驗表明，乙腈+0.1%乙酸水溶液作為流動相并采用梯度洗脫時，四種代謝物的衍生物分離度和靈敏度較高。流動相梯度洗脫條件見表7-3。

3)蜂蜜樣品

比較了Pinnacle II C18，5um，150mm×2.1mm；Hypersil C18 5um，150mm×4.6mm；Inertsil ODS-3，5μm，150mm×2.1mm，ZORBAXSB-C18，3.5um，150mm×2.1mm，四種液相分析柱對四種硝基呋喃代謝物的分離效果，結果發現，ZORBAXSB-C18，3.5um，150mm×2.1mm分析柱，靈敏度和分離度都較理想。因此，選擇該柱為分析柱。

為了優化流動相，對比了甲醇+乙酸銨水溶液、乙腈+乙酸水溶液作流動相的色譜效果，實驗表明，乙腈+0.4%乙酸水溶液作為流動相并采用梯度洗脫時，四種代謝物的衍生物分離度和靈敏度較高。流動相梯度洗脫條件見表7-4。

(4)質譜條件的選擇

取四種硝基呋喃代謝物標準溶液20μg/mL，用2-NBA衍生化，分別得到2-NBA-AOZ，2-NBA-AM0Z，2-NBA-SEM，2-NBA-AHD標準衍生溶液。以5μL/min流速分別將四種代謝物標準溶液的衍生物注入離子源。在正離子檢測方式下分別對其進行一級質譜分析(Q1掃描)得到分子離子峰。再對分子離子進行二級質譜分析(子離子掃描)，得到二級質譜圖，見圖7-4。然后再對去簇電壓(DP)、聚焦電壓(FP)、碰撞氣能量(CE)及碰撞室出口電壓(CXP)等參數進行優化，使分子離子與特征碎片離子強度達到最大，確定最佳質譜參數。將液相色譜與質譜聯機，對霧化氣流量，霧化室溫度，噴霧針位置等參數進一步優化，使各種參數達到最佳。

圖7-4 四種硝基呋喃代謝物二級質譜圖

(5)定量方式的選擇

實驗了外標法和內標法兩種定量方式。標準溶液和樣品溶液基質相同時，二者區別不大。標準溶液和樣品溶液基質不同時，硝基呋喃代謝物衍生物的離子化效率不同，用內標法定量更準確。

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