硝基呋喃類代謝物最大允許殘留限量和分析技術(shù)——前處理方法（一）

時間：2023-03-25 05:10:47來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

硝基呋喃類代謝物最大允許殘留限量和分析技術(shù)——前處理方法（一）

[db:作者] / 2022-12-12 00:00

7.1.3 最大允許殘留限量

研究表明NFs能夠誘導(dǎo)突變并具有致癌性和慢性毒性，為了保障消費者的健康安全，目前，絕大多數(shù)國家已經(jīng)明令禁止該類藥物用于食品動物的生產(chǎn)飼養(yǎng)。澳大利亞于1992年撤銷了NFs的最高殘留限量，禁止其使用；歐盟于1993年在2377/90/EEC的附錄IV中規(guī)定禁止將呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮用于食品動物，1995年又將呋喃唑酮列入，并規(guī)定檢測動物源產(chǎn)品中NFs的方法靈敏度的最低要求為1.0μg/kg)；加拿大于1997年將NFs列為禁用藥物；2002年，美國FDA公布了禁止在食品動物中使用的藥物名單，其中包括呋喃西林、呋喃唑酮等NFs；2006年，日本實施的“肯定列表制度”也將NFs列入禁用物質(zhì)清單。我國農(nóng)業(yè)部于2002年頒布了193號公告，將NFs列入《食品動物禁用獸藥及其他化合物清單》，在動物性食品中不得檢出。

7.1.4殘留分析技術(shù)

NFs在動物體內(nèi)代謝快，半衰期短，檢測原藥不足以反映真實的殘留水平和用藥情況。在NFs的檢測方法研究中,歷經(jīng)了從檢測原型藥物到檢測代謝物的發(fā)展歷程,而對NFs代謝物殘留量的分析，已成為當(dāng)前研判NFs濫用與否的重要技術(shù)手段。同時，由于組織中結(jié)合殘留物的濃度可能非常低，需要采用高靈敏度的檢測技術(shù)，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法(LC-MS/MS)和免疫學(xué)方法如酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，已成為國際上最常用的硝基呋喃代謝物殘留檢測方法。

7.1.4.1前處理方法

NFs屬于光敏物質(zhì)，對太陽光特別敏感，因此樣品前處理的操作必須避免在強烈光照下進行。

(1)樣品洗滌

近年來研究發(fā)現(xiàn)，NFs代謝物特別是氨基脲(SEM)產(chǎn)生機理復(fù)雜、來源多樣，濫用呋喃西林并，不是導(dǎo)致檢出SEM的唯一原因。為了準確反映NFs的真實使用情況，降低外源性物質(zhì)對檢測結(jié)果的干擾，在部分動物源食品中只測定結(jié)合態(tài)代謝物，洗去游離態(tài)代謝物，可以降低誤判的風(fēng)險。郭德華等依次用甲醇、乙醇和乙醚溶劑提取，使動物源性樣品中呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因等4種NFs游離態(tài)代謝物進入提取液，而結(jié)合態(tài)代謝物保留在殘渣中。在酸性條件下用2-硝基苯甲醛分別衍生游離態(tài)和結(jié)合態(tài)代謝物，經(jīng)乙酸乙酯提取濃縮后，用LC-MS/MS檢測，同位素內(nèi)標法定量，將兩者測定結(jié)果相加即得到樣品中NFs代謝物的殘留總量。我國國家標準《GB/T21311-2007動物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測方法高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法》對于肌肉、內(nèi)臟、魚、蝦和腸衣等組織樣品，采用甲醇-水(1+1,v/v)充分洗滌后，棄去溶液，只分析結(jié)合態(tài)的NFs代謝物，避免外源性污染干擾。

(2)水解和衍生化

NFs代謝物主要以蛋白結(jié)合物形態(tài)存在于有機體組織中，只有在適當(dāng)?shù)乃嵝詶l件下，才能釋放出來，通常采用稀鹽酸水解組織中的蛋白結(jié)合態(tài)代謝物。同時，NFs代謝物均為小分子化合物，SEM、AOZ、AHD、AMOZ和DNSAH的相對分子質(zhì)量分別為75.1、102.1、115.1、201.2和242.1，質(zhì)譜檢測時特征離子少，背景干擾大，檢測靈敏度很低，給定性和定量分析帶來困難。衍生化則可以增加分子質(zhì)量，增強化合物的色譜保留，使化合物遠離質(zhì)譜的高噪音質(zhì)量區(qū)，增加特征碎片離子的選擇性，提高質(zhì)譜響應(yīng)。因此，研究者通過對代謝物的自由氨基進行衍生化，增大化合物的分子量，形成一個具有較好質(zhì)譜特性的化合物，再進行分析。

通常采用鄰硝基苯甲醛(2-NBA)作為衍生化試劑，但需要較長的反應(yīng)時間，一般要求在37℃下衍生16h。為了縮短衍生化的時間，Alexander等希望用其他芳香族醛(如吡啶-3-羧基甲醛、2,2-二硝基苯甲醛、2-羥基-5-硝基苯甲醛)來提高檢測靈敏度或縮短反應(yīng)時間。然而，并沒有明顯的改善。實驗發(fā)現(xiàn)，衍生化反應(yīng)率大約為70%，且在不同濃度水平下未觀察到顯著變化。丁磊等比較了40℃恒溫振蕩16h、水浴超聲1h、恒溫靜置16h等3種條件下2-NBA的衍生效率。研究發(fā)現(xiàn)，除AOZ外，其他3種呋喃代謝物衍生效率在40℃水浴超聲1h條件下的產(chǎn)率最高。龐國芳等18對比了2-NBA和對硝基苯甲醛(4-NBA)的衍生化效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用4-NBA做衍生化試劑，衍生產(chǎn)物靈敏度較低，衍生時間的延長對質(zhì)譜信號沒有提高，而背景噪音的干擾增加較大。

目前，2-NBA是常用的衍生化試劑。衍生化反應(yīng)機理可歸納為：在酸性條件下，衍生劑的酮醛基團(-CHO)與不同代謝物的含氮親核基團氨基(-NH2)發(fā)生醛胺親核加成反應(yīng)。通過衍生化，NFs代謝物衍生產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分別達到了208.2、248.2、235.2、334.3和375.3，增大分子質(zhì)量的同時提高了離子化效率和質(zhì)譜檢測靈敏度。蛋白結(jié)合態(tài)NFs代謝物在酸性條件下，同步水解和衍生化反應(yīng)過程見圖7-2。

圖7-2 蛋白結(jié)合態(tài)NFs代謝物的同步水解和衍生化過程

也有研究者采用鄰氯苯甲醛(2-CBA)或2-萘醛(NTA)作為衍生化試劑。朱堅建立了用LC-MS法測定雞肉和水產(chǎn)品蝦中NFs代謝物AOZ和AMOZ殘留量的方法。樣品經(jīng)酸水解，用鄰氯苯甲醛衍生化，再經(jīng)SPE柱凈化后，用LC-MS檢測，檢測低限為0.3×10-9數(shù)量級。林黎明等分別以鄰氯苯甲醛和鄰硝基苯甲醛作為衍生化試劑，用ENSPE柱凈化，以AMOZ-d5、AOZ-d4作內(nèi)標，采用LC-MS分析雞組織及蛋中4種硝基呋喃類代謝產(chǎn)物。方法回收率為85%～90%，檢出限可達0.5μg/kg。Chumanee等叫在測定蝦肉中4種NFs代謝物中，引入了一種新的衍生化試劑——2-萘醛(NTA)。20g蝦肉樣品在0.2mol/LHCI的酸性條件下，加入20mmol/L的NTA、0.12g NaOAc、1gKCl，37℃避光過夜反應(yīng)。衍生化之后用乙酸乙酯提取，最后用正已烷液液萃取除脂。衍生化的NFs代謝物在ChromSpher 5 C18柱(250mm×4.6mm，5μm)上進行分離，洗脫順序為NTAHD<NTSEM<NTAOZ<NTAMOZ，二極管陣列檢測器(DAD)進行測定，NTAHD的檢測波長為310nm，其余為308nm。在1μg/kg、1.5μg/kg、2μg/kg三個濃度水平水平進行添加回收實驗，回收率高于86%，變異系數(shù)(CV)小于14%。AHD、AOZ、SEM、AMOZ的定量限(LOQ)分別為0.7803μg/kg、0.7973μg/kg、0.6973μg/kg和0.9118μg/kg，檢出限(LOD)均在0.2μg/kg左右。該方法為NFs代謝物的檢測提供了更多的選擇。

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