甾類同化激素類藥物殘留分析技術(shù)——前處理方法（三）

時間：2023-03-25 05:24:45來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

甾類同化激素類藥物殘留分析技術(shù)——前處理方法（三）

[db:作者] / 2022-12-12 00:00

3)免疫親和色譜(immunoffinity chromatography，IAC)

IAC的原理是將抗體固定在固相載體材料上，制成免疫親和吸附劑，將樣品溶液通過吸附劑，樣品中的目標(biāo)化合物因與抗體發(fā)生免疫親和作用而被保留在固相吸附劑上。然后用緩沖液或有機溶劑作為洗脫劑，使目標(biāo)化合物與抗體解離，從而使目標(biāo)化合物被萃取和純化。與傳統(tǒng)的SPE相比，利用抗原-抗體結(jié)合機制進(jìn)行凈化的IAC柱具有更好的選擇性，凈化效果好，可重復(fù)多次使用，但是一般只能用于單組分或特定種類化合物殘留的凈化。

徐燕等將去氫甲睪酮多克隆抗體同CNBr-Sepharose 4B 進(jìn)行偶聯(lián)，制成了對去氫甲睪酮具有特異性免疫性吸附的IAC柱，并優(yōu)化了制備和使用條件；同時，用間接競爭酶聯(lián)免疫(ELISA)和HPLC法對該IAC柱的性能進(jìn)行了評價。CNBr-Sepharose4B偶聯(lián)抗體的最佳反應(yīng)時間為2.5h，抗體最佳初始質(zhì)量濃度為0.5mg/mL，IAC的柱容量約為1700ngDMT/g干膠，最佳洗脫溶液為80%甲醇溶液。該柱平均加標(biāo)回收率為97.87%，重復(fù)使用三次后，回收率仍不低于90%。Gasparini等建立了一種同時檢測牛尿中諾龍、群勃龍殘留的LC-MS/MS確證分析方法。牛尿用β-葡糖苷酸酶過夜酶解，冷卻至室溫后，離心收集上清液，過IAC柱凈化。IAC柱用淋洗液活化后上樣，淋洗液和水淋洗，甲醇-水(70+30，v/v)洗脫，氮氣吹干，甲醇-水(50+50，v/v)復(fù)溶上樣。方法CCa為0.54～0.60μg/L，回收率大于64%，批間RSD為1.6%～5.7%，批內(nèi)RSD為1.6%～6.0%。

4)凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography，GPC)

GPC是根據(jù)分析物的相對分子質(zhì)量或者體積進(jìn)行分離，相對分子質(zhì)量大的先流出，相對分子質(zhì)量小的后流出，適用于脂肪等大分子物質(zhì)中小分子藥物的凈化。Kaklamanos等采用GPC凈化了腎脂肪中促孕激素(醋酸甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸美侖孕酮)。樣品經(jīng)正已烷稀釋后，加入二氯甲烷，再用GPC凈化。GPC采用1000mm×25mm內(nèi)徑玻璃色譜柱，填充生物珠(S-X3，200～400目)進(jìn)行凈化，流速為5mL/min，最大耐受壓力150psi，紫外檢測波長設(shè)定為254nm。收集35～44min流出液，40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸干，復(fù)溶后，反相LC-MS/MS分析。該方法的CCa為0.20～0.22ng/g，CCβ為0.33～0.38ng/g，回收率為72.0%～89.2%。

5)基質(zhì)固相分散萃取(matrix solid phase dispersion，MSPD)

MSPD是一-種快速、簡單、廉價、高效耐用的樣品處理技術(shù)，其基本操作是把樣品直接與適量的反相鍵合硅膠-起混合研磨，使樣品被均勻分散于固定相顆粒表面制成半固態(tài)，裝入層析柱中，然后采用類似SPE的操作進(jìn)行洗滌和洗脫。MSPD避免了樣品勻化、轉(zhuǎn)溶、乳化、濃縮造成的待測物損失。MSPD技術(shù)使用樣品量少，要求檢測方法具有較高的靈敏度。Dong等開發(fā)了基于MSPD原理的凈化技術(shù)，凈化水產(chǎn)品中的雌激素。采用乙腈提取魚肉和蝦肉中4種雌激素(17β-雌二醇、雌三醇、4-羥雌二醇和2-甲氧基雌二醇)，渦動混勻，再加入硫酸鎂和氯化鈉，混勻后，冷凍離心。將上清液轉(zhuǎn)移，加入50mg乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)和100mg無水硫酸鎂，渦動混勻后離心。上清液過膜后，直接采用HPLC-熒光檢測器(FLD)分析。4-羥雌二醇平均回收率為60%，其他3種藥物平均回收率高于80%，日內(nèi)RSD小于12%。

6)渦流色譜萃取(turbulent flow chromatography，TFC)

渦流色譜技術(shù)是利用大粒徑填料使流動相在高流速下產(chǎn)生渦流狀態(tài)，從而對生物樣品進(jìn)行凈化與富集?，F(xiàn)已經(jīng)發(fā)展成為一種直接進(jìn)樣、快速凈化和分離生物樣品的前處理技術(shù)。Moeller等開發(fā)和驗證了一種定量檢測馬血清中35種ASs的方法，可同步檢測血清中的雄激素、雌激素、孕激素及其代謝產(chǎn)物。該方法采用二維液相系統(tǒng)(2D-LC)，在線TFC提取，帶有電噴霧離子源(ESI)的LC-MS/MS測定，通過SRM或選擇離子監(jiān)測(SIM)對分析物進(jìn)行鑒定和定量。2D-LC-TFC-MS/MS具體參數(shù):一維分離時采用Thermo Cyclone P提取柱(50mm×0.5mm，60μm)進(jìn)行稀釋血清樣品提取，二維分離采用ACE C18分析柱(100mm×2.1mm，3μm)進(jìn)行反相梯度洗脫，柱溫為30℃；流動相分別為0.2%甲酸溶液、甲醇、乙腈異丙醇-丙酮(60+30+10，v/v)和含0.1%氨水的水-乙腈(98+2，v/v)；四元泵用于在線樣品提取，二元泵用于反相梯度分離。進(jìn)樣后，血清中分析物經(jīng)TFC提取，然后轉(zhuǎn)移至二維色譜分離，采用MS/MS檢測。該研究對分析物的回收率及基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了評價，大多數(shù)分析物的日間及日內(nèi)CV均低于20%，準(zhǔn)確度差異在20%以內(nèi)；其LOD及LOQ分別為0.025～10ng/mL和0.125～25ng/mL。該方法已應(yīng)用于英國良種馬內(nèi)源性甾醇類物質(zhì)的監(jiān)測。

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