β-內酰胺類藥物殘留分析技術——衍生化方法

時間：2023-03-25 07:23:13來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

β-內酰胺類藥物殘留分析技術——衍生化方法

[db:作者] / 2022-12-09 00:00

(3)衍生化方法

1)紫外檢測衍生

β-內酰胺環母體的紫外檢測波長在200～235nm之間，紫外吸收缺乏特征性，干擾組分影響較大，因此應用液相色譜檢測時往往需要衍生化，使其具有特征吸收。衍生化分為柱前和柱后兩種。其中，柱后衍生需另外加泵、反應芯、T型混合器、脫氣機等，操作復雜；而廣泛使用的柱前衍生化是在咪唑或1，2，4-三唑催化下，將青霉素反應形成青霉烷酸硫醇汞衍生物。

Sorensen等采用HPLC測定動物組織中7種PENs時，用苯甲酸酐衍生化藥物結構中的氨基，降低化合物極性，再用1，2，4-三唑-氯化汞衍生化，60℃恒溫水浴衍生化1h，使其生成最大吸收為323nm的衍生物。7種PENs的LOD為8.9～20.9μg/kg，平均回收率在58%～82%之間。劉媛等建立了反相HPLC分析雞肉、豬肉、豬皮、豬脂肪等動物組織樣品中阿莫西林殘留量的方法。對4種動物組織樣品采用磷酸鹽緩沖溶液提取、三氯乙酸沉淀蛋白，C18固相萃取柱凈化，然后采用1，2，4-三唑-氯化汞衍生化試劑，60℃恒溫水浴衍生化1h，HPLC在323nm處檢測。該方法測得阿莫西林在8.6～860μg/L線性范圍內線性相關(r=0.9997)；動物組織樣品中阿莫西林的加標回收率為70.9%～86.8%，RSD為3.2%～16.4%；LOD低于10μg/kg；批內、批間RSD均小于10%。

Beconi-Barker等建立了豬肉、肝臟、腎臟以及脂肪組織中頭孢噻呋及其代謝物殘留量的HPLC方法。采用赤藻糖醇鹽緩沖液提取，碘代乙酰胺柱前衍生，加入3mL碘乙酰胺，渦動混勻后室溫放置30min，用5%磷酸溶液調至pH2.5～2.6，然后將組織樣品離心，C18固相萃取柱凈化，HPLC在266nm檢測。方法回收率在70%～95%之間，LOD為100μg/kg。

2)熒光檢測衍生

也有反應形成熒光衍生物的衍生化方法報道。

羅道栩等用三氯乙酸溶液沉淀牛奶蛋白并提取氨芐青霉素殘留，將氨芐青霉素和甲醛在酸性條件下加熱生成2-羥基-3-苯基-6-甲基吡嗪，再用FLD進行檢測。熒光檢測激發波長為346nm，發射波長為422nm。該方法測得氨芐青霉素的LOD為1μg/L，LOQ為2μg/L，回收率為70%～110%，批內CV小于10%，批間CV小于15%。Popelka等采用柱前衍生化法檢測雞肉中5種PENs。樣品經0.01moL/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5)勻質，30%三氟乙酸沉淀蛋白，離心過濾，上清液經甲醛衍生化(100℃反應45min)，然后經二乙醚提取，HPLC-FLD檢測，激發波長和發射波長分別為346nm、422nm。方法測得5種藥物的LOD為5μg/kg。Iwaki等采用柱前熒光衍生化測定PENs，衍生化時首先堿性水解待測物，使β-內酰胺環打開產生伯胺基團，該功能基又與7-氟-4-硝基苯-2-草酸-1，3-二唑反應，產生具有熒光特性的物質，激發波長為470nm，發射波長為530nm。該方法LOD為30～85ng/mL，線性范圍為0.2～100μg/mL。

CEPs也可以通過衍生化反應后采用熒光檢測器測定。Meng等建立了一種檢測人血漿中頭孢氨芐的HPLC-FLD柱前衍生化方法。頭孢氨芐在5mmoL/L硼酸鹽溶液(pH8.5)中經芴甲氧羰酰氯(FMOC-CI)進行衍生化，25℃反應15min，衍生化產物經XDB-C18色譜柱分離，激發波長和發射波長分別為268nm、314nm。該方法測得血漿中頭孢氨芐的LOD為0.014ug/mL，線性范圍為0.0234～58.5μg/mL。Blanchin等建立了一種檢測血漿和尿液中6種CEPs(頭孢克洛、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢沙定、頭孢甘酸和頭孢羥氨芐)的HPLC方法。采用熒光胺柱后衍生化，衍生化系統為4.5m×0.25mmi.d.的PTPE毛細管線圈，衍生劑流速為0.25mL/min，在室溫下反應，駐留時間為10.6s。血漿中的回收率為88.7%～105.6%，尿液中的回收率為86.2%～113.6%。作者比較了熒光檢測和紫外檢測在相同色譜條件下的線性關系、重復性和檢測限。結果顯示，熒光檢測靈敏度約為紫外檢測靈敏度的兩倍，熒光檢測6種CEPs的LOD為0.3～1.8mg/L，紫外檢測的LOD為0.6～2.7mg/L。

3)氣相色譜檢測衍生

β-內酰胺類藥物為強極性、熱不穩定性和難揮發性化合物，采用氣相色譜測定時，需要進行甲酯化衍生反應來提高其揮發性和降低極性。Preu等建立了牛肉中青霉素的GC檢測方法。樣品凈化液用氮吹蒸干后，加入100μL重氮甲烷進行衍生化，再用GC-NPD或GC-MS進行檢測。該方法測得青霉素的LOD為3ug/kg。Meetsehen等用GC測定動物組織中7種PENs。用重氮甲烷衍生化，形成易揮發的青霉素甲基酯類化合物，有效提高了檢測靈敏度和再現性，其回收率在46%～73%之間。

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