β-內酰胺類藥物殘留分析技術——凈化方法（二）

時間：2023-03-25 07:24:38來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

β-內酰胺類藥物殘留分析技術——凈化方法（二）

[db:作者] / 2022-12-09 00:00

3)基質固相分散萃取(matrix solid-phase dispersion，MSPD)

MSPD 是一種快速樣品處理技術。其基本操作是把樣品直接與適量的反相鍵合硅膠一起混合研磨，使樣品被均勻分散于固定相顆粒表面制成半固態，裝入層析柱中，然后采用類似SPE的操作進行洗滌和洗脫。MSPD技術使用樣品量少，要求檢測方法具有較高的靈敏度。Karageorgou等用Strata-X做吸附劑，MSPD法提取牛奶中5種PENs藥物。Strata-X吸附劑經2mL甲醇和2mL水活化，加入牛奶樣品進行混合，超聲波水浴中超聲10min進行勻質，隨后樣品轉移至一個空的貯存器進行壓縮，真空干燥吸附劑。接著加入5mL水(含1%丙酮)淋洗吸附劑，分析物分別用1mL甲醇、1mL乙腈洗脫，蒸干，再用Oasis HLB柱凈化，HPLC檢測。方法檢測限(CCa)為35.2～56.3μg/kg，檢測能力(CCβ)為39.9～61.9μg/kg；RSD小于16%。

4)分散固相萃取(dispersive solid phase extraction，DSPE)

分散固相萃取是美國農業部于2003年提出使用的一-種新的樣品前處理技術。該技術是選擇對不同種類藥物都具有良好溶解性能的溶液作為提取劑，凈化吸附劑直接分散于待凈化的提取液中，吸附基質中的干擾成分。該方法回收率高，前處理時間短，溶劑使用量少，操作簡便，具有很好的發展前景和推廣價值。Mastovska等測定牛腎臟中11種β-內酰胺類抗生素，取1g樣品至50mL離心管中，加入2mL水和8mL乙腈進行提取，渦動混勻，劇烈晃動5min，離心收集上清液。然后在上清液中加入500mg C18吸附劑，渦動混勻，晃動30s，離心。取5mL上清液轉移至帶刻度的試管中，旋蒸至體積小于1mL，用水定容至1mL，濾膜過濾后進LC-MS分析。除頭孢噻呋代謝物(去呋喃甲酰基頭孢噻呋)回收率低外，其他化合物的回收率均在87%～103%之間。

5)QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe)

QuEChERS是近年來國際上最新發展起來的一種用于農產品檢測的快速樣品前處理技術。原理與HPLC和SPE相似，都是利用吸附劑填料與基質中的雜質相互作用，吸附雜質從而達到除雜凈化的目的。Karageorgou等采用基于超聲輔助MSPD方法，開發出QuEChERS技術提取與凈化牛奶中的阿莫西林、氨芐西林、苯唑西林、雙氯西林和氯唑西林。用乙腈提取后，200mgStrata-X、150mg MgSO4、50mg PSA、50mg C18作為QuEChERS凈化劑，采用HPLC進行檢測。方法的日內精密度低于16%，5種藥物的CCa為35.2～56.3μg/kg，CCβ為39.9～61.9μg/kg，滿足歐盟法規2002/657/EC要求。Perez-Burgos等建立了一種LC-MS/MS同時檢測牛肉中7種CEPs殘留的QuEChERS方法。樣品經乙腈-水(80+20，v/v)提取后，采用QuEChERS方法進行凈化。將10mL樣品提取液加入含有150mg PSA、150mg C18吸附劑和900mg MgSO4的試劑盒。然后輕輕晃動5min，3500r/min離心5min收集上清液。取5mL上清液氮氣吹干，200μL水復溶后上樣分析。結果顯示，采用傳統SPE方法的LOQ稍低(0.1～10μg/kg)，兩種凈化方法的LOQ均低于MRLs，但QuEChERS方法精密度高于SPE方法，兩種方法均獲得較好的回收率，除頭孢氨芐外，其他藥物回收率均高于85%。

6)分子印跡技術(molecular imprinting technology，MIT)

MIT以待測物為模板分子，通過共價鍵結合或非共價鍵結合聚合物單體，然后將聚合物單體交聯，再將模板分子從聚合物中提取出來，聚合物內部就留下了模板分子的印跡，成為能選擇性吸附待測物的功能高分子材料-分子印跡聚合物(MIP)。Cederfur等合成了以青霉素G為模板的高選擇性MIP填料。稱取1mmoL/L青霉素G至硼硅玻璃管中，加入乙腈超聲溶解，加入甲基丙烯酸溶解青霉素G，預聚合反應混合物放在冰上進行冷卻，氮吹10min。然后在Rayonet光化學反應器中，在350nm、4℃下共聚反應24h，反應結束后進行離心，收集大小為25～50μm的聚合物。將顆粒物分別用甲醇-乙酸(1+4，v/v)、甲醇、乙腈和甲醇進行孵育，然后真空干燥顆粒物。制備MIP后，合成聚合物文庫，然后從文庫中篩選與青霉素G結合的聚合物，對MIP進行放射性配體競爭結合試驗。研究發現，該MIP填料與其他幾種PENs交叉反應率小于19%，蔡夫西林和苯唑西林交叉反應率小于1%，與頭孢匹林和其他結構不相關的抗生素(氯霉素、四環素、氨苯砜和紅霉素)的交叉反應率低于0.01%。Zhang等甲基丙烯酸作為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯做交聯劑，偶氮二異丁腈作為引發劑合成青霉素G的MIP填料，凈化牛奶中青霉素G。牛奶經乳酸桿菌發酵形成酸奶，取10mL牛奶加入10mg MIP，混勻5min進行提取，分離青霉素GMIP后，牛奶繼續進行發酵。該方法測得青霉素G的靈敏度達10μg/kg。

7)免疫親和色譜(immunoffinity chromatography，IAC)

IAC是用色譜柱技術，把抗體固定在適當的支持物上，制備出用于樣品分離純化的IAC柱，其再與色譜聯用，達到很好的分離檢測效果。利用抗體與抗原/半抗原可逆的生物專一性相互作用來達到凈化和富集分析物的目的。具有高度的選擇性和特異性，特別適用于復雜樣品基質中痕量組分的分離和富集。將IAC作為理化測定技術的樣品凈化手段，使樣品前處理大大簡化，通常一次層析即可使待測物得到高度凈化和富集；同時，使用多種抗體制備的IAC柱(MIAC)使免疫分析具備了處理多殘留組分的能力。Dietrich等通過免疫小鼠獲得抗氨芐西林單克隆抗體。純化后的Mab1D1與CNBr活化的Sepharose 4B偶聯，制備出IAC柱。該IAC柱對氨芐西林和氯唑西林的吸附量分別為6.6μg/mL和5.4μg/mL。緩沖液中阿莫西林、氨芐西林、氯唑西林、雙氯西林、青霉素G和苯唑西林在IAC柱的回收率分別為67%～100%。陳號以青霉素類藥物母核6-氨基青霉烷酸(6-APA)偶聯牛血清蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)分別合成兩種免疫原和包被原，制備出高效價的抗6-APA的抗血清，經活性檢測后被純化，純化的IgG偶聯CNBr活化的Sepharose4B制備IAC柱，采用HPCE方法對IAC柱柱效進行初步評價。建立的青霉素G標準曲線在1～100μg/mL范圍內線性良好，青霉素G樣品添加回收率為76.38%～94.67%，CV為5.67%～15.91%。

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