β-內酰胺類藥物殘留分析技術——凈化方法（一）

時間：2023-03-25 07:26:28來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

β-內酰胺類藥物殘留分析技術——凈化方法（一）

[db:作者] / 2022-12-09 00:00

(2)凈化方法

目前文獻報道動物組織中β-內酰胺類藥物的凈化方法主要有:液液分配(LLP)、固相萃取(SPE)和基質固相分散技術(MSPD)等。

1)液液分配(liquidliquidpartition，LLP)

在早期的樣品凈化方法中，主要應用LLP實現樣品的凈化。樣品經過提取后含有較多雜質，初提液不能直接進行儀器分析，需要再進行一步凈化除去干擾物質。對于有機酸類β-內酰胺類藥物，酸化后其結構中的羧基電離被抑制，使藥物呈中性，可通過LLP對其進行有效的凈化。Meetsehen等測定了動物源性食品中7種PENs殘留，經乙醚-二氯甲烷LLP凈化后，回收率在41%～92%之間。

Lihl等檢測牛肌肉組織中5種青霉素，采用乙腈-磷酸鹽溶液提取，二氯甲烷LLP凈化。但這種方法不適用于兩性β-內酰胺類藥物提取，尤其是青霉素G，因此在LLP中，酸化后立即加入二氯甲烷或氯仿提取，避免因時間過長而藥物分解。該方法測得PENs的平均回收率為60%～103%，CV為6%～11%。LLP存在操作費時、需要溶劑量大、實驗結果重復性差、易產生乳化現象等問題，在β-內酰胺類藥物殘留分析中的應用越來越少。

2)固相萃取(solidphaseextraction，SPE)

SPE不需要大量的有機溶劑，不易產生乳化現象，不僅更有效，而且更容易實現自動、快速萃取動物源食品中殘留的痕量藥物。Marazuela等綜述了動物源食品中β-內酰胺類獸藥殘留檢測的前處理技術，將SPE列為最有效的凈化手段。在β-內酰胺類藥物的SPE凈化中，主要采用反相填料，如C18 [6.16.28]、HLB [8.1.22.29]等。

A.HLB柱

在反相SPE凈化時，上樣溶液中的有機溶劑可能會增加淋洗強度，不利于目標化合物的保留，因此需先濃縮去除有機溶劑，再進行SPE凈化。

Becker等D用乙腈-水提取牛奶、牛肉和牛腎臟中15種β-內酰胺類抗生素，旋轉蒸發去除有機溶劑，pH8.5的磷酸鹽緩沖液復溶后，用以親水-親脂平衡材料(二乙烯基苯-co-N-乙烯基吡咯烷酮聚合物)為吸附基質的Oasis HLB柱凈化，乙腈-水(1+1，v/v)為洗脫液，回收率為71%～116%。Sorensen等建立了一種同時檢測肌肉、肝臟和腎臟組織中7種PENs的多殘留檢測方法。樣品經硫酸和鎢酸鈉沉淀蛋白后，經磷酸鹽緩沖液提取，采用Oasis HLB柱凈化。HLB柱用2mL甲醇、2mL水活化，上樣后，用2mL 25mmoL/L磷酸鹽緩沖液(pH9.0)淋洗，抽干后，用4mL乙腈洗脫。接著采用乙醚進行LLP凈化。凈化液采用苯甲酸酐和1，2，4-三唑汞試劑進行衍生化后，HPLC-紫外檢測器(UVD)分析。該方法測得阿莫西林、青霉素G、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林的LOD為8.9～11.1μg/kg，雙氯西林為18.3～29.9ug/kg；平均回收率在58%～82%之間。白國濤等30]測定牛肉中9種CEPs藥物殘留時，采用Oasis HLB凈化，乙腈-水(7+3，v/v)洗脫，回收率為74%～119%。張琦等建立了牛奶中阿莫西林、頭孢氨芐、氨芐西林和青霉素V的檢測方法。試驗分別比較了Oasis HLB柱、C18柱、OasisMAX柱的回收率，結果表明HLB柱回收率最高，除了阿莫西林外，其余3種抗生素的平均回收率均高于70%。

B. C18柱

CisSPE柱也廣泛用于β-內酰胺類藥物殘留檢測。

Terada等使用Sep-PakC18柱凈化海產品中的青霉素G。Sep-PakC18柱首先用20mL甲醇、20mL水、2mL 2%氯化鈉溶液預洗，提取液以2mL/min的速度過柱，然后依次用10mL 2%氯化鈉溶液和10mL甲醇-水-20%氯化鈉溶液(3+15+2，v/v)淋洗，最后青霉素G用19mL水洗脫。在牛肝臟、腎臟、肌肉中添加1μg/g濃度的回收率為75.0%～92.6%，RSD為2.35%～4.06%，LOD為0.05μg/g。Bioson等用BondElut C18柱代替Sep-PakC18柱，在研究中發現，Sep-PakC18柱填料的碳含量小于14%，而BondElut C18柱的碳含量為18%。實驗結果表明，為了從SPE柱中得到大于70%的回收率，C18柱填充料的碳含量至少應為17%。因此，在使用SPE凈化的方法中，要使藥物的損失最小，必須考慮SPE柱的碳含量。此外，緩沖溶液的濃度、種類以及洗脫溶液的用量等因素都會對回收率有影響。實驗表明，當磷酸鹽的濃度低于0.07moL/L時，回收率也隨之降低，特別是兩性β-內酰胺類藥物，更需一定的緩沖溶液，使其保留在SPE柱上；同時，為防止磷酸鹽緩沖液進入洗脫液阻塞色譜柱，洗脫前要先用水淋洗。

C.陰離子交換柱

陰離子交換SPE柱能有效地保留有機弱酸類β-內酰胺類藥物。

Meetsehen等采用氣相色譜(GC)方法測定動物源食品(牛肉、牛肝臟、牛腎臟、脂肪組織和牛奶)中7種PENs的殘留。樣品用乙腈在酸性條件下提取，然后加入氯化鈉和二氯甲烷進行LLP凈化，接著用陰離子交換柱凈化。上樣后，經0.1%磷酸溶液淋洗，乙腈洗脫。該方法測得動物源食品中7種PENs的平均回收率為50%～80%，LOD小于3μg/kg。Preu等建立了牛肉中青霉素的GC方法。樣品經乙腈和磷酸鹽緩沖液(pH 2.2)提取，多種溶劑對LLP凈化后，再采用陰離子交換柱進行凈化，凈化液氮吹蒸干后，加入100μL重氮甲烷進行衍生化，使用GC-氮磷檢測器(NPD)或氣相色譜-質譜(GC-MS)進行檢測。該方法測得青霉素的LOD為3μg/kg。

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