硝基呋喃類代謝物最大允許殘留分析技術(shù)——測定方法（二）

時間：2023-03-25 05:40:31來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

硝基呋喃類代謝物最大允許殘留分析技術(shù)——測定方法（二）

[db:作者] / 2022-12-12 00:00

(3)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)

LC-MS串聯(lián)技術(shù)擁有高效的分離能力，出色的檢測靈敏度和較強(qiáng)的克服雜質(zhì)干擾能力，是目前測定NFs代謝物最主要的技術(shù)手段，而LC-MS/MS則是最常用的方法。

1)液相色譜-單級質(zhì)譜法(LC-MS)

LC-MS是將單四極桿質(zhì)譜儀作為一種檢測器與LC連接，是LC-MS儀的早期產(chǎn)品。與LC-MS/MS相比，在靈敏度和選擇性上都要相差不少，主要用在NFs及其代謝物檢測技術(shù)的早期開發(fā)上。

1996年Horne等開發(fā)了AOZ和AMOZ的LC-MS檢測方法。用鄰硝基苯甲醛衍生，經(jīng)LLP后，用LC-MS測定，肝臟樣品的檢測限為10μg/kg。朱堅建立了雞肉和蝦中AOZ和AMOZ殘留量的LC-MS測定方法。樣品用酸水解，鄰氯苯甲醛衍生化，經(jīng)SPE柱凈化后，用LC-MS檢測。在電噴霧電離(ESI)正離子、選擇離子監(jiān)測(SIM)模式下，方法檢測低限為0.3×10-9數(shù)量級。林黎明等建立了雞組織及蛋中4種NFs代謝產(chǎn)物的LC-MS方法。用AMOZ-d5，AOZ-d4作內(nèi)標(biāo)，經(jīng)ENSPE柱凈化，以乙腈-0.1%甲酸為流動相，采用梯度洗脫，可在15min內(nèi)將4種代謝產(chǎn)物完全分離并進(jìn)行測定。方法回收率為85%～90%，檢出限可達(dá)0.5μg/kg。徐維海等采用LC-MS方法研究呋喃唑酮及其代謝產(chǎn)物AOZ在羅非魚體內(nèi)的殘留規(guī)律。在大氣壓化學(xué)電離源(APCI)電離模式下，呋喃唑酮及其代謝物AOZ的檢出限分別為10μg/kg和1μg/kg。

2)液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法(LC-MS/MS)

由于出色的靈敏度、選擇性，而且還能夠提供禁用藥物確證所需的結(jié)構(gòu)信息，LC-MS/MS已成為NFs代謝物檢測最常用的方法，也是大多數(shù)國家和組織認(rèn)可的方法。

A.組織樣品分析

Alexander等首次報道用LC-MS/MS同時分析動物肌肉組織中4種NFs代謝物的方法。分析物被酸性水解，后從組織中釋放，用2-硝基苯甲醛衍生化，利用SPE凈化樣品，LC-MS/MS在ESI正離子、MRM模式下檢測。4種NFs代謝物AOZ、AMOZ、SEM、AHD的LOD分別為0.5ng/g、0.5ng/g、3.0ng/g、5.0ng/g，LOQ分別為2.5ng/g、2.5ng/g、10.0ng/g、10.0ng/g，測定響應(yīng)值的線性范圍從檢測限到800ng/g之間。彭濤等也率先在國內(nèi)報道了用LC-MS/MS測定動物組織中NFs代謝物的方法。鹽酸水解組織中蛋白結(jié)合代謝物，同時加入2-硝基苯甲醛，37℃過夜衍生。上清液調(diào)pH7.0后，用OasisHLB柱凈化。采用ESI電離，正離子，選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)模式檢測。三離子原則，外標(biāo)法定量。LOQ為AMOZ、AOZ 0.1ng/g，SEM、AHD 0.5ng/g；LOD為AMOZ、AOZ 0.05ng/g，SEM、AHD 0.1ng/g，低于歐盟規(guī)定的1μg/kg的方法靈敏度要求。在添加濃度0.5～10ng/g范圍內(nèi)，AMOZ回收率為65.4%～91.3%，SEM回收率為62.7%～94.6%，AHD回收率為63.9%～89.4%，AOZ回收率為67.8%～90.9%，RSD均小于4.8%。龐國芳等建立了用LC-MS/MS測定禽肉組織中AOZ、AMOZ、SEM和AHD4種NFs代謝物的方法。0.2mol/L鹽酸水解禽肉組織中與蛋白結(jié)合的NFs代謝物，用2-硝基苯甲醛37℃衍生16h。上清液調(diào)pH7.4后，用LiChrolutEN柱凈化，乙酸乙酯洗脫，流動相定容。采用ESI電離，正離子掃描，MRM模式檢測。標(biāo)準(zhǔn)曲線用空白禽肉樣品添加標(biāo)準(zhǔn)與樣品同步操作獲得，并用其進(jìn)行外標(biāo)定量。在添加濃度0.5～10μg/kg范圍內(nèi)，4種代謝物的平均回收率在70.2%～89.1%之間；LOD為AMOZ、AOZ0.1 μg/kg，SEM、AHD0.2μg/kg；4種代謝物L(fēng)OQ均為0.5μg/kg；10次測定結(jié)果RSD在5.59%～10.10%之間。Verdon等采用LC-MS/MS方法，測定了火雞肌肉中的5種NFs(呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、硝呋柳肼)的代謝產(chǎn)物SEM、AOZ、AMOZ、AHD、DNSAH。將水解、衍生的過程從37℃ 16h縮短至55℃ 4h，結(jié)果表明對測定并無顯著影響。采用乙酸乙酯提取，內(nèi)標(biāo)法定量，由于DNSAH暫無同位素內(nèi)標(biāo)，采用由另一化合物硝呋酚酰肼得到的水楊酸肼作為內(nèi)標(biāo)校正。該方法同樣適用于其他家禽肌肉、蜂蜜、雞蛋和豬組織，LOQ均低于0.5μg/kg。Bock等驗證了檢測雞肉和蝦肉中的4種NFs代謝物的確證方法，并進(jìn)行了不確定度評價。方法用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的代謝物進(jìn)行內(nèi)標(biāo)法定量，不同的樣品基質(zhì)以及樣品狀態(tài)(新鮮或者凍干樣品)均會導(dǎo)致內(nèi)標(biāo)的回收率發(fā)生變化，從而影響方法的準(zhǔn)確度，因此需要同時應(yīng)用內(nèi)標(biāo)和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線才能實現(xiàn)準(zhǔn)確定量。在穩(wěn)定性試驗中，樣品可以在-25℃下保存12個月。方法的CCa為0.1～0.7μg/kg，CCβ為0.1～0.9μg/kg，CV在7%～17%之間。趙善倉等開發(fā)了畜產(chǎn)品中4種NFs代謝物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)快速檢測方法。樣品經(jīng)衍生化后，用乙酸乙酯提取，正己烷凈化，流動相定容。采用ESI電離，正離子掃描，MRM方式采集數(shù)據(jù)，外標(biāo)法定量。在添加濃度為0.1～2.0ug/kg范圍內(nèi)，4種代謝物的平均回收率在67.3%～85.0%之間，10次測定結(jié)果的CV在2.0%～9.7%之間；最低檢出限均達(dá)到0.15μg/kg；在0.1～20.0ng/mL的線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r均大于0.99。實現(xiàn)了樣品檢測的快速和高靈敏，適用于豬肉和豬肝中NFs代謝物的殘留檢測。劉紅衛(wèi)等采用UPLC-MS/MS，ESI電離，正離子模式，對腸衣中4種NFs代謝物殘留量進(jìn)行定性定量檢測。用甲醇、水脫脂去除部分雜質(zhì)，經(jīng)OasisHLB小柱富集凈化后，用Waters ACQUITY UPLC TM BEH C18色譜柱分離，以0.3%乙酸乙腈溶液和0.3%乙酸溶液為流動相，梯度洗脫。在MRM模式下以保留時間和離子對(母離子和兩個子離子)信息比較進(jìn)行定性，以響應(yīng)值高的子離子進(jìn)行定量。該法的檢出限為0.2～0.5μg/kg，加標(biāo)回收率為86%～97%，RSD小于10%。

B.蜂產(chǎn)品分析

丁濤等報道了LC-MS/MS測定蜂王漿中呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃它酮4種NFs代謝物殘留的方法。以三氯乙酸作為蜂王漿的蛋白質(zhì)沉淀劑，同時提供衍生化反應(yīng)所需的酸性環(huán)境；使用4種同位素內(nèi)標(biāo)，補(bǔ)償了衍生化效率、衍生后樣品溶液的pH及光照對定量結(jié)果所產(chǎn)生的影響，極大地提高了定量的準(zhǔn)確性。實驗結(jié)果表明，呋喃它酮代謝物的LOD可以達(dá)到0.03μg/kg，其他3種代謝物可以達(dá)到0.05μg/kg(S/N大于5)；呋喃它酮代謝物的LOQ可以達(dá)到0.20μg/kg，其他3種代謝物可以達(dá)到0.25μg/kg(S/N大于10)；線性范圍為0.4～20ng/mL，添加回收率為97.7%～104.8%(內(nèi)標(biāo)校正)，RSD為2.7%～9.7%。Khong等建立了檢測蜂蜜中NFs代謝物的同位素稀釋LC-MS/MS方法。HPLC分析柱為反相C18柱(150mm×2.1mm，3.5μm)，流動相為水(含0.025%的乙酸)和乙腈，采取線性梯度洗脫的方式，流速為0.3mL/min，分析物在正離子模式進(jìn)行分析，ESI源，源溫為300℃，毛細(xì)管電壓為5.5kV，掃描模式為MRM。氘代化的NFs代謝物隨樣品一起衍生化，以內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行準(zhǔn)確定量。NFs的檢測靈敏度達(dá)到1.0μg/kg，在此濃度進(jìn)行添加回收實驗，回收率為82%～112%。AHD、AMOZ、AOZ、SEM的CCa分別為0.46μg/kg、0.07μg/kg、0.12μg/kg、0.36ug/kg，CCβ分別為0.56μg/kg、0.12μg/kg、0.18μg/kg、0.43μg/kg。在篩查市場上蜂蜜的用藥情況時，100多個蜂蜜樣品中的14%含有AOZ，21%含有SEM。余建新等采用微量化樣品前處理技術(shù)，以鄰硝基苯甲醛為衍生劑，ESI正離子、MRM方式建立了蜂蜜中4種NFs代謝物殘留量同時測定的LC-MS/MS方法。方法的檢出限為0.02～0.3ng/g，線性范圍均大于102，線性方程的相關(guān)系數(shù)r大于0.997，回收率為79.0%～95.6%。

C.乳、蛋分析

彭濤等用LC-MS/MS法同時測定奶粉中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因的代謝物。鹽酸水解奶粉中蛋白結(jié)合的代謝物，同時加入2-硝基苯甲醛，37℃過夜衍生化。加入硫酸鋅，調(diào)pH7.0后，再加入亞鐵氰化鉀去除蛋白。然后用乙酸乙酯提取，正已烷凈化，分析物采用ESI正離子、MRM模式檢測，內(nèi)標(biāo)法定量。在添加濃度0.5～2μg/kg范圍內(nèi)，內(nèi)標(biāo)法回收率為89.5%～110.3%；RSD小于11.3%。AMOZ、AOZ的LOD為0.05μg/kg，SEM、AHD為0.1μg/kg。Chu等應(yīng)用LC-MS/MS方法檢測了牛奶中的NFs代謝物的殘留量。液相色譜的流動相為甲醇和20mmol/L乙酸銨，串聯(lián)質(zhì)譜在APCI正離子模式下，應(yīng)用MRM進(jìn)行采集數(shù)據(jù)。每個監(jiān)測離子對的駐留時間為150ms，離子源溫度為350℃，離子噴霧電壓為5.5kV。此方法中4種藥物的回收率為83%～104%，CV均小于13%；AOZ、SEM、AHD和AMOZ的LOD分別為0.1ng/g、0.2ng/g、0.2ng/g、0.1ng/g，LOQ為0.2ng/g。

曹文卿等建立了蛋黃粉中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮等NFs代謝物殘留的LC-MS/MS測定方法。利用硅藻土為基質(zhì)分散劑對蛋黃粉進(jìn)行基質(zhì)分散，三氯乙酸溶液沉淀蛋白并提供水解環(huán)境，2-硝基苯甲醛衍生化，乙酸乙酯液液萃取等前處理手段對蛋黃粉中的硝基呋喃代謝產(chǎn)物進(jìn)行了提取和凈化，LC-MS/MS檢測。方法測定低限為0.5μg/kg，線性范圍為0.5～6.0μg/kg，室內(nèi)驗證回收率范圍為90.06%～109.8%，RSD為2.0%～7.7%。Bock等建立了雞蛋中NFs代謝物的LC-MS/MS方法，并進(jìn)行了驗證。AHD和SEM的CCa和CCβ均在0.2μg/kg左右，AMOZ的CCa和CCβ在0.05μg/kg左右，AOZ的CCa和CCβ低于0.05μg/kg。

D.血漿、血清分析

Radovnikovic等建立了UHPLC-MS/MS方法用于動物血漿中(牛、羊、馬和豬)的4種NFs代謝物(AHD、AOZ、SEM、AMOZ)的確證檢測。血漿樣品用2-硝基苯甲醛衍生化，隨后用有機(jī)溶劑萃取，萃取液濃縮，然后通過UHPLC-MS/MS分析。該方法根據(jù)歐盟委員會決議2002/657/EC進(jìn)行了驗證。AHD、AOZ、SEM和AMOZ的回收率分別為72%、74%、57%和71%；CCa分別為0.070μg/kg、0.059μg/kg、0.071μg/kg和0.054μg/kg。這種方法可作為農(nóng)場獸藥監(jiān)控制的替代方法。Tai等應(yīng)用LC-MS/MS測定了畜牧場及肉品市場豬血清中4種NFs藥物代謝物殘留。樣品通過水解蛋白質(zhì)鍵合的藥物代謝物，并與2-硝基苯甲醛衍生化，通過乙酸乙酯LLP進(jìn)行凈化，然后將乙酸乙酯層用氮氣流蒸發(fā)至干，將殘余物重新溶解于50%甲醇溶液，0.22um過濾器過濾后，采用ZORBAX eclipse XDB-C18柱分離，ESI正離子模式電離，在MRM模式下進(jìn)行LC-MS/MS分析。方法LOQ為0.2ppb；SEM、AOZ、AHD和AMOZ的回收率分別為75.0%～97.6%、90.0%～92.6%、92.0%～84.4%和94.0%～94.2%，其標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.06、0.04、0.06和0.05；對950個樣品進(jìn)行了檢測，其中2例樣品中AOZ和AH和呈陽性，其測定的濃度范圍為2.5～19.4ppb。

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