阿維菌素類藥物殘留測定方法（二）

時間：2023-03-24 21:01:41來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

阿維菌素類藥物殘留測定方法（二）

[db:作者] / 2022-12-26 00:00

(3)高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)

AVMs屬于低極性化合物，利用反相-高效液相色譜(RP-HPLC)能獲得較好的選擇性。在AVMs殘留分析中采用HPLC的方法報道較多，主要利用紫外檢測器(UVD)、二極管陣列檢測器(PDADAD)和熒光檢測器(FLD)測定。

1)紫外檢測器(UVD)

AVMs的共軛二烯結構在240～250nm處有強烈的紫外吸收，利用此特點，可建立紫外檢測法，但在此光譜區域存在著皮質激素、維生素、脂類、核酸等眾多內源性物質，會嚴重干擾檢測。另外，AVMs在體內的最小有效濃度很低，如IVM在血漿中的最小有效濃度為0.5～1.0ng/mL，而在報道的HPLC-UVD方法中，靈敏度-般很難低于2ug/kg，難以滿足分析要求。因此，采用UVD測定的方法并不多。

曹紅等建立了HPLC-UVD法測定綿羊血漿中AVM的殘留量。樣品經乙酸乙酯提取后直接進HPLC測定。分離色譜柱為SHIMPAVKCLC-ODS柱，乙腈-含0.1%磷酸的磷酸二氫鉀緩沖液(65+35，v/v)為流動相，流速1.0mL/min，檢測波長245nm。該方法LOD為4ng/mL。Massarollo等報道了采用HPLC-UVD檢測蜂蜜中AVM的殘留分析方法。樣品經LLE提取，SPE凈化后，進RP-HPLC測定。以乙腈-甲醇-水為流動相，245nm檢測。方法LOD和LOQ分別為0.002mg/kg和0.007mg/kg，回收率在73.4%～97.45%之間，RSD為0.91%～13.7%。Li等建立了豬肝中IVM的HPLCUVD測定方法。樣品用甲醇提取，經IAC柱凈化后進RP-HPLC檢測，UVD在245nm下定量。方法LOD為2ug/kg，回收率在85%～102%之間，CV為6%～12%。Garcia-Mayor等報道了采用HPLC檢測羊奶中IVM的殘留分析方法。樣品經MSPD技術處理后，進HPLC檢測。色譜柱為Hypersil ODS柱(5um，250mm×4.6mm)，柱溫60℃，25mmol/L KH2PO4(pH7)和乙腈為流動相，梯度洗脫，流速1.2mL/min，在245nm檢測。該方法回收率為74%～97%，RSD在1.6%～9.0%之間。

2)二極管陣列檢測器(PDA/DAD)

二極管陣列檢測器(PDADAD)能實現對流出的色譜峰進行瞬間的全光譜掃描，同時得到色譜峰保留值、純度和吸收光譜方面的信息。由于AVMs殘留的確證方法一般比較復雜，當樣品中藥物殘留水平較高時，PDADAD可以成為一種選擇。通過對峰保留時間、吸收光譜形狀與標準品的相似性，做出初步確證。Campillo等報道了檢測奶中AVM、IVM、DOR、EPR和MOX的HPLC分析方法。樣品經DLLME技術提取后，用HPLC-DAD檢測，基質添加標準曲線定量，方法LOQ在1.0～4.7ng/g之間。

3)熒光檢測器(FLD)

由于AVMs本身沒有對稱共軛結構，不能直接用FLD檢測，只有經衍生化后，生成具有對稱共軛的苯環結構才能發射熒光，故選擇適宜的熒光衍生化試劑及反應條件顯得非常重要。AVMs的熒光衍生一般遵循酰化、脫水然后成芳香環的機制(圖21-1)，但熒光衍生物存在不穩定性的問題尚有待解決。FLD使檢測的選擇性和靈敏度顯著提高，靈敏度較UVD約低1～2個數量級，可滿足AVMs殘留分析的要求。

圖21-1 AVM的熒光衍生機制

Tolan等建立了血漿中IVM的分析方法。干燥后的提取物使用吡啶做催化劑，以醋酸酐為脫水劑，在105～110℃反應22～24h，熒光衍生反應產物經硅膠柱凈化后，用RP-HPLC-FLD測定。激發波長和發射波長分別為364nm和480nm，方法的LOD為0.5μg/kg，RSD小于8%。Tway等報道了牛羊肝臟、脂肪和肌肉組織中IVM的HPLC-FLD測定方法。提取物在90℃溫度下，用強親核催化劑(N-甲基咪唑)和溶劑DMF衍生化反應1h，衍生產物進HPLC分析。方法回收率為83%，LOD可達1～2μg/kg。Norlander等檢測豬肝臟中的IVM，采用類似的衍生化方法和FLD檢測條件，方法平均回收率為87%，LOD為0.5～1μg/kg。De Montigny等采用強酰化劑三氟醋酸酐(TFAA)代替醋酸酐，以乙腈做溶劑，反應條件和操作步驟簡單快速，不需要進一步的凈化步驟。將動物血漿提取物中的溶劑吹干，加入100μL TFAA-乙腈(1+2，v/v)溶解殘留物，再加入150uL N-甲基咪唑-乙腈(1+1，v/v)后，立即密閉(產生大量白霧并放熱)，待白霧消失后，反應溶液可直接HPLC-FLD測定。該方法IVM的LOD可達到20pg/mL，同時衍生副產物減少。Rabel等用激光誘導熒光檢測器(LIFD)測定血漿中IVM殘留。窄徑HPLC梯度洗脫與傳統的熒光檢測對血漿中IVM的LOQ為0.01ng/mL左右，而等度色譜條件與LIFD結合也能夠達到0.01ng/mL的靈敏度。同時，自動衍生化進樣操作可以減少手動操作，并消除潛在分析物/內標物的降解。

Payne等采用HPLC-FLD測定牛組織中的EPR。由于AVMs的熒光衍生試劑不太穩定，在2h內將損失50%，作者開發了-種自動化的衍生化過程。在這一過程中，樣品提取液重新在甲基咪唑-乙腈溶液中再生，然后轉移至進樣瓶中供HPLC系統分析。在進樣前利用自動進樣器的混合功能，再往進樣瓶中加入適量TFAA充分混勻。該方法LOD為1ng/g，LOQ為2ng/g；回收率為87%～100%，CV小于13%。Flajs等在對奶和血漿中DOR殘留分析時，將干燥濃縮的提取物在室溫下加入100uL N-甲基咪唑的乙腈溶液(1+1，v/v)和150μL TFAA(1+2，v/v)進行衍生化，再進HPLC-FLD分析。色譜柱為Supelcosil LC-8-DB柱(150mm×4.6mm，5um)，流動相為乙腈-甲醇-水(470+470+60，v/v)，流速1.1mL/min，激發波長364nm，發射波長470nm。分析結果表明，奶中DOR的LOD為0.04ug/kg，CCa為0.1ug/kg，檢測能力(CCβ)為0.13ug/kg。Sutra等報道了檢測狗血漿中SEL的HPLC-FLD方法。提取物經自動SPE凈化后，用TFAA和N-甲基咪唑衍生，進HPLC測定，激發波長355nm，發射波長465nm。該方法LOD為0.1ng/mL。

Rupp等測定大西洋鮭魚肌肉組織中的IVM和DOR，提取物用C8和硅膠柱凈化后，用TFAA和N-甲基咪唑脫水處理，衍生形成熒光產物，該產物隨后用乙酸銨-甲醇溶液溶解轉換形成穩定的醇形式，該反應在50～55℃下需要15min。再用HPLC-FLD檢測，色譜柱為Hypersil C18柱，流動相為乙腈-水(90+10，v/v)，柱溫65℃，激發波長272nm，發射波長465nm。IVM和DOR的回收率分別為75%～89%和73%～85%，RSD小于7%；LOD為0.25ppb。Knold等報道了采用乙腈提取，TFAA柱后衍生，AVM為內標，以HPLC-FLD法測定豬肝中的IVM和DOR。樣品用乙腈提取，上清液濃縮至近干，加110uL 1-甲基咪唑溶解，室溫反應2min后，進HPLC檢測。色譜柱為HypersilODS柱，水-乙腈(6+94，v/v)為流動相，柱溫30℃，梯度洗脫，激發波長365nm，發射波長470nm。添加濃度為15ug/kg時，IVM和DOR的回收率分別為75%和70%，LOD為0.8ug/kg，LOQ為1.6μg/kg。

Ali等采用HPLC-FLD測定牛肝臟中的AVM、IVM、DOR、EPR和MOX殘留時，AVM、IVM、DOR和MOX的衍生化產率瞬間可達到峰值，而EPR的產率則需要7h才能達到峰值。加熱到65℃，EPR反應速度快，90min時產率最高，其他藥物的產率亦增加10%～15%。方法回收率大于70%，CV小于20%。侯曉林等采用HPLC分離，FLD檢測，建立了SPE分析牛組織中EPR、AVM、DOR和IVM殘留的方法。樣品用乙腈提取，堿性氧化鋁和C18柱凈化，用乙酸酐和1-甲基咪唑的乙腈溶液作衍生化試劑，在96℃條件下，完全衍生化需要100min。4種藥物的平均回收率為70.02%～88.75%，日內CV小于8.52%，日間CV小于7.13%。EPR、AVM、DOR和IVM的LOD為0.4～0.5μg/kg，LOQ為2ug/kg。Roudaut等報道了檢測肝臟組織中AVM、IVM、DOR和MOX的HPLC方法。樣品用乙腈提取，C18柱凈化，TFAA衍生化后進HPLC-FLD檢測，激發波長361nm，發射波長465nm。方法LOQ滿足歐盟的MRLs要求，回收率在77.5%～90.8%之間，RSD為2.7%～7.7%。Hou等檢測牛肝和牛肉中EPR、AVM、DOR和IVM殘留。樣品用乙腈提取，C18柱凈化，衍生化反應后，用HPLC-FLD測定。牛肝中的回收率為70.31%～87.11%，牛肉為79.57%～93.65%，RSD分別小于17.84%和14.68%；方法LOD為0.5～1.0ng/g，LOQ為1～2ng/g。

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