大環內酯類和林可胺類藥物殘留分析技術前處理方法——凈化方法

時間：2023-03-25 05:47:42來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

大環內酯類和林可胺類藥物殘留分析技術前處理方法——凈化方法

[db:作者] / 2022-12-12 00:00

(2)凈化方法

獸藥殘留分析的凈化步驟非常關鍵，通過凈化起到去除生物樣品中的脂肪、蛋白等干擾物質的目的，同時也可以提高檢測靈敏度，延長儀器和色譜柱的壽命。MALs和林可胺類藥物前處理過程中涉及的凈化方法主要有液液分配、固相萃取、基質固相分散等。

1)液液分配(liquidliquidpartition，LLP)

LLP是利用待測組分與樣品雜質在互不相溶的兩種液體里溶解性不同而得到凈化的一種方法。其優點是溶劑易得，而且價格便宜。但也存在一定的缺點，包括乳化現象的形成和待測物在兩相中存在互相的溶解性。氯仿和二氯甲烷常用于從水或堿性溶液中萃取MALs，缺點在于毒性高且易污染環境。Draisci等利用磷酸鹽緩沖液、水和氯仿進行牛組織中MALs藥物的提取及LLP凈化，經渦動離心后液體分為三層：上層為水相，中層為組織相，下層為氯仿相，收集下層進--步固相萃取凈化后，進LC-MS/MS測定。方法回收率在80.4%～90.2%之間，RSD小于14.9%；LOQ在20～150μg/kg之間。

2)固相萃取(solidphaseextraction，SPE)

與LLP相比，SPE不需要使用大量有機溶劑，處理過程中不會產生乳化現象，能簡化樣品的處理過程，但是SPE柱的使用成本較高。盡管如此，SPE仍然是MALs和林可胺類藥物樣品凈化中的主流技術。在MALs和林可胺類藥物殘留分析中，常用的SPE柱主要有基于反相機理的C18柱和HLB柱，以及基于離子交換機理的SCX柱和WCX柱等。從文獻報道的結果來看，SCX柱和HLB柱對MALs和林可胺類藥物的凈化效果較好。

反相C18 SPE是許多中等或低極性藥物常用的凈化方法。Thompson等應用C18 SPE柱對蜂蜜中的泰樂菌素和林可霉素進行凈化。C18柱用5mL甲醇和5mL水進行活化，蜂蜜首先與10mL的碳酸鹽緩沖液進行混合稀釋后.上柱，用4mL 5%的甲醇-水和4mL 70%的甲醇-水洗滌，再用甲醇和乙腈進行洗脫，濃縮后LC-MS檢測。在0.01μg/g、0.5μg/g、10μg/g三個添加濃度水平，林可霉素和泰樂菌素的平均回收率為84%～107%；LOD為：泰樂菌素0.01ug/g，林可霉素0.007μg/g。陳明等報道了牛奶中克林霉素殘留量的檢測方法。牛奶樣品用20%乙酸溶液和水超聲振蕩提取，離心后，上清液過C18固相萃取柱，用4mL水淋洗，再用6mL甲醇洗脫，經氮吹儀吹干后，用流動相溶解定容：至1mL，過0.22um濾膜后，進行HPLC分析。克林霉素濃度在1.0～10.0μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系，平均回收率為80.3%～93.9%，CV為1.23%～3.47%，LOD為0.5μg/mL。謝文等建立了蜂王漿中5種MALs殘留量的HPLC方法，并對OasisHLB和C18固相萃取柱的凈化效果進行了比較。首先使用HLB(3mL，60mg)和(6mL，500mg)兩種規格的小柱，加入50ng混合標準溶液后，用甲醇-水(2+8，v/v)洗滌，雖可去除樣品中色素等雜質，但結果顯示MALs同時也被不同程度地洗脫下來，降低了方法回收率；同樣條件用于C18柱，MALs損失率較小。因此該方法選用C18固相萃取柱進行凈化。5種MALs在0.002～0.05mg/L范圍內具有良好的線性關系，加標回收率和相對標準偏差較好。

HLB吸附劑是由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物。它以反相保留機理為主，并通過一個特殊的極性捕獲基團來增加對極性物質的保留以提供較好的水浸潤性。Adams等在蜂蜜樣品中加入磷酸緩沖液，置于45℃水浴中10min，再渦旋以使蜂蜜均勻散開，用OasisHLB柱進行凈化。SPE柱用甲醇和提取液活化，上樣后用40%的甲醇洗滌，0.5%氨化乙腈洗脫，氮氣吹干后復溶于50%的甲醇-水中檢測，建立了蜂蜜中林可胺類藥物的測定方法。劉正才等用OasisHLB固相萃取小柱對烤鰻中13種林可胺類和MALs進行凈化。SPE柱先用甲醇和水活化，樣品液流干后用5%甲醇洗滌，再用甲醇洗脫，吹干、復溶并過濾后，LC-MS/MS測定。研究者比較了HLB與C18萃取柱的凈化和富集效果，發現前者相對較好，在0～100ug/L范圍內，峰面積與質量濃度有良好的線性關系，相關系數大于0.99，在1.0μg/kg、2.0μg/kg、4.0μg/kg三個濃度水平進行添加回收實驗，平均回收率為70.26%～124.22%，RSD為1.31%～16.00%。

由于MALs呈弱堿性，還可以采用基于陽離子交換機理的SPE柱凈化。張敬平等用甲醇提取雞肝中6種MALs，然后用BondElutSCX固相萃取柱凈化，LC-MS檢測。該方法的LOD為1～10μg/L，在0.05～0.7μg/mL范圍內線性關系良好，相關系數大于0.996；在0.5μg/g、0.1μg/g兩個添加水平下，回收率范圍為78.5%～93.4%，RSD小于7.2%。該研究比較了三種不同保留機理的SPE柱對MALs的富集效果:反相保留機理的BondElut C18柱(100mg，1mL)和OasisHLB柱(200mg，3mL)，離子交換保留機理的BondElutSCX柱(500mg，3mL)，以及混合保留機理的BondElutPlexa柱(200mg，3mL)。結果表明SCX柱和HLB柱的保留效果較好，最終從凈化效果考慮，選擇SCX柱作為樣品凈化柱。

3) 基質固相分散萃取(matrixsolid-phasedispersion，MSPD)

MSPD的原理是將涂漬有C18等多種聚合物的擔體固相萃取材料與樣品一起研磨，得到半干狀態的混合物并將其作為填料裝柱，然后用不同的溶劑淋洗柱子，將各種待測物洗脫下來。其優點是濃縮了傳統樣品前處理中的樣品勻化、組織細胞裂解、提取、凈化等過程，不需要進行組織勻漿、沉淀、離心、pH調節和樣品轉移等操作步驟，避免了樣品的損失，使分析者能同時制備、萃取和凈化樣品。Bogialli等的研究表明，對于MALs來說，熱水可作為一種較好的萃取劑而避免了有機溶劑的使用，且不會影響方法的準確度。將牛奶分散于硅藻土中，最終目標分析物將在70℃加熱的狀態下通過30mmol/L的甲酸作用下經過MSPD柱洗脫下來，洗脫液經過pH值調節和過濾，可直接用HPLC分析測定，牛奶中MALs的回收率可達到68%～86%。Frenich等利用MSPD進行了雞蛋中MALs的提取與凈化處理，首先將0.5g雞蛋與2g的C18擔體材料進行玻璃杵均勻混合，直到均一黃色物質出現為止，然后裝柱(含2g硅酸鎂載體，并事先過夜加熱至130℃活化處理)，經甲醇、乙腈、35%氨水-甲醇(0.04%，v/v)進行洗脫，最后氮吹濃縮后復溶后UPLC-MS/MS分析。方法回收率在60%～119%之間，RSD小于25%；LOQ小于等于5μg/kg。

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