牛奶和奶粉中甲硝唑、洛硝噠唑、二甲硝唑及其代謝物殘留量測定分析條件的選擇

[db:作者] / 2022-12-21 00:00

16.2.1.7 分析條件的選擇

(1)提取凈化

牛奶樣品為高蛋白液態樣品，參考文獻試驗了不同的提取劑，乙腈甲醇能很好地沉淀蛋白，但對羅硝唑的提取率只有60%左右且濃縮時比較費時。乙酸乙酯能很好地提取出五種目標分析物但是不能沉淀蛋白，提取溶液很容易乳化。5g樣品先加入5mL乙腈來沉淀蛋白，再加入20mL乙酸乙酯來提取分析物，便解決了以上單一有機溶劑提取時遇到的問題。所以方法提取溶液選擇5mL乙腈+20乙酸乙酯提取兩次。

硝基咪唑類藥物為兩性化合物，在弱酸性溶液中呈分子狀態。根據其性質，在添加水平5ug/kg，試驗了不同類型的固相萃取柱，包括C18柱(反相萃取柱)，硅膠、氧化鋁柱(正相萃取柱)，SCX柱(強陰離子交換柱)。結果表明，用C18柱凈化效果較差，基質影響比較嚴重；用硅膠柱和氧化鋁柱處理的凈化效果也不好且五種藥物的絕對回收率小于60%；而用SCX柱不僅可以消除干擾而且回收率在90%以上。這是因為強陽離子交換柱上的磺酸基能有效的吸附質子化的硝基咪唑類藥物，即使是極性強的有機溶劑亦不能洗脫。這樣就可以用丙酮、甲醇淋洗掉大部分干擾成分，然后用5%氨水-乙腈置換洗脫目標分析物。由洗脫曲線(見圖16-3)可知前2mL洗脫液未將分析物洗脫下來，而后4mL洗脫液可將5種藥物從固相萃取柱.上完全洗脫下來。同時硝基咪唑類藥物熱不穩定，在氮吹一步應注意不能將其完全吹干，若完全吹F就會降低方法的回收率，尤其是二甲硝咪唑吹干后會損失30%左右。

圖16-3 硝基咪唑類藥物在SCX柱上的累積洗脫曲線

(2)色譜條件的建立

實驗采用了0.1%乙酸-乙腈做流動相，采用時間梯度洗脫，在150mm×2.1mm(i.d.)，填料顆粒直徑4.6μm的苯基柱分離待測組分，分析物在最大程度上得到了分離，且峰對稱尖銳，加之質譜的高選擇性，通過MRM色譜圖能夠較好的定性定量5種分析物，無內源干擾物影響組分的測定。

(3)質譜條件的建立

用蠕動泵以10μL/min注入1μg/mL的混合標準溶液來確定各化合物的最佳質譜條件，包括選擇特征離子對，優化電噴霧電壓、鞘氣、輔助氣、碰撞能量等質譜分析條件。分析物的混標液和內標混合液進入ESI電離源，在正、負離子掃描方式下分別對分析物進行-級全掃描質譜分析，得到分子離子峰。5種分析物及3種內標均在正模式下有較高的響應，負模式下信號值很低。然后對各分子離子峰進行二級質譜分析(多反應監測MRM掃描)，得到碎片離子信息，各化合物的[M+H]離子碎裂機理可用圖16-4表示。

圖16-4 硝基咪唑類藥物分子離子MRM模式下的裂解示意圖

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