硝基咪唑類藥物測定方法——免疫分析法

時間：2023-03-24 23:05:00來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

硝基咪唑類藥物測定方法——免疫分析法

[db:作者] / 2022-12-21 00:00

(7)免疫分析法(immuno analysis，IA)

免疫學檢測方法是基于抗原_抗體反應原理設計的測定藥物殘留的分析方法。免疫分析不需要復雜儀器設備，降低了檢測成本，且靈敏度高，操作簡便快速。目前，硝基咪唑類藥物殘留分析中采用較多的免疫方法主要有酶聯免疫分析方法和免疫傳感器方法。

1)酶聯免疫分析法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化以及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性，讓抗體與酶復合物結合，然后通過顯色來檢測。

MNZ是一種小分子，本身并不具備免疫原性，必須將其與具有免疫原性的載體蛋白相偶聯生成完全抗原才具有免疫原性。由于MNZ本身沒有氨基、羥基或羧基等活性基團，需要進行結構改造。Wang等測定動物源食品中硝基咪唑類藥物，首先在堿性條件下將RNZ的2位酯鍵水解生成MNZOH，MNZOH與戊二醛合成MNZ半抗原，分別采用混合酸酐法將半抗原與小牛血清蛋白(BSA)反應生成包被抗原，用碳二亞胺法(EDC)將半抗原與血藍蛋白反應生成免疫抗原，獲得了硝基咪唑類藥物的單克隆抗體，用間接顯色ELISA法檢測硝基咪唑抗體。方法的IC50分別為0.20ng/mL(MNZ)、4.0ng/mL(TNZ)、0.17ng/mL(DMZ)和0.24ng/mL(ORZ)，與MNZ、TNZ、DMZ、RNZ、ORZ和SNZ的交叉反應率分別為100%、5%、121%、82%、16%和20%，與其他結構或功能相似的藥物交叉率很小。在食品中的LOD為0.1ng/mL，檢測雞肉、雞肝和蝦肉中硝基咪唑類藥物的回收率為74.0%～90.6%，CV小于14%。

也可以將硝基還原為氨基后再與蛋白偶聯。Huet等用水合肼法將MNZ硝基還原成氨基，再用EDC法合成抗原，以避免載體蛋白自身的氨基和羧基在交聯劑作用下發生自身交聯，從而最大限度地減少反應副產物的生成。免疫過程中，在合成抗原的誘導下，機體產生針對載體BSA決定簇和半抗原決定簇的抗體。以此建立了檢測禽蛋和雞肉中MNZ、DMZ、RNZ、IPZ以及MNZOH等5種硝基咪唑類藥物的ELISA法。樣品用乙腈萃取，正己烷除脂后，ELISA檢測。不同藥物回收率在18%～98%之間；蛋和雞肉中DMZ的LOD分別小于1μg/kg和2μg/kg，MNZ的LOD小于10μg/kg，RNZ和HMMNI的LOD均小于20μg/kg，而IPZ的LOD小于40μg/kg。

2)免疫傳感器(bioimmunosensor)

免疫傳感器由偶聯抗原/抗體分子的生物敏感膜與信號轉換器組成的，將抗原抗體特異性免疫反應信號轉化為其他信號再進行檢測。硝基咪唑類藥物檢測主要采用光學免疫傳感器，光學免疫傳感器使用光敏元件作為信息轉換器。將涂有抗體的光纖浸入溶液中來檢測溶液里的抗原，溶液中抗原與抗體結合，再將結合了抗體的光纖浸入含有被熒光標記的抗原溶液里，帶有熒光指示劑的抗原會與競爭抗體結合，在光纖的另一端加上光源，將返回一個熒光信號。待測試抗體的濃度越高，就有更多的熒光標記抗原與其結合，返回的熒光信號就越強。Thompson等研制了檢測動物肝臟、腎臟、禽蛋、牛奶和血清中硝基咪唑類藥物的光纖免疫傳感器。通過免疫綿羊MNZ蛋白結合物獲取多克隆抗體，交叉反應表明所獲得的多克隆抗體可以結合至少7種主要硝基咪唑及其代謝物(包括RNZ、IPZ、MNZ、MNZOH、HMMNI和IPZOH)，樣品用乙腈提取離心后直接測定。DMZ的CCβ小于1μg/kg或mg/L。Connolly等也利用硝基咪唑多克隆抗體，制備了可同時測定禽肉中DMZ、MNZ、RNZ、MNZOH和HMMNI的光纖生物傳感器。DMZ、MNZ和RNZ的CCβ小于1ppb，另外兩種代謝物的CCβ小于2ppb。

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