苯并咪唑類藥物殘留分析技術——提取方法

時間：2023-03-24 23:15:09來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

苯并咪唑類藥物殘留分析技術——提取方法

[db:作者] / 2022-12-21 00:00

(2) 提取方法

1)液液萃取(liquid liquid extraction，LLE)

LLE是BMZs殘留分析中經常采用的提取方法。由于BMZs以及其代謝物的極性和pK。不同，不僅多種藥物同時檢測非常困難，而且個別藥物及其代謝產物的檢測也比較困難。一些研究者采用單一溶劑如乙腈來提取殘留物；或者在中性條件下采用水有機溶劑二元溶液來提取BMZs和代謝物；也有少數研究者在需要水解時，或者只檢測少數幾個代謝物時，采用酸化溶劑提取BMZs和代謝物。常見的提取溶劑有乙酸乙酯、乙腈、二甲亞砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙醚和二氯甲烷等。

乙酸乙酯是采用較多的有機溶劑。Capece等用硼砂-HCl緩沖液調pH至8.0后用乙酸乙酯從肌肉、脂肪和腎組織中提取殘留的FBZ。該方法基于將FBZ及其亞砜代謝物氧化成砜代謝物(FBZ-SO2)。提取物無需凈化，直接用HPLC測定。在豬肝臟、肌肉、腎臟和脂肪組織中的添加回收率大于69.8%，變異系數(CV)小于15%。 De Ruyck等在堿性條件下( 加入5mL 0.1mol/L NaOH)用乙酸乙酯從雞蛋和肌肉中提取FLU、FLU-HMET 和FLU-RMET。蒸干提取液，用甲醇-正已烷液液分配凈化后，液相色譜-質譜/質譜(LC-MS/MS)分析。FLU、FLU-HMET和FLU-RMET在雞蛋和肌肉中的回收率大于70%。該作者測定綿羊肝組織中MBZ的殘留標示物。在樣品中加入1mL 1mol/L NaOH堿化樣品，然后用乙酸乙酯提取MBZ、MBZ-NH2和MBZ-0H。MBZ殘留標示物的回收率大于85%。Shaikh等用乙酸乙酯提取三文魚、羅非魚和鱒魚組織中的ABZ、ABZ-SO、ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2，其回收率分別大于82%、78%、75%和63%。研究發現，提取液中加入DMSO可以提高ABZ回收率；加入偏亞硫酸氫鈉能夠抑制ABZ-SO氧化為ABZ-SO2，提高ABZ-SO的回收率；使用碳酸鉀溶液調pH至9、10和11時，ABZ及其殘留標示物的提取效率存在差異但并不顯著。Fletouris等發現在pH9.8時，用乙酸乙酯能夠很好的從奶樣中提取ABZ、ABZ-SO和ABZ-SO2，回收率分別為81%、78%和100%。Alvinerie等在不調節血漿pH的情況下，直接用乙酸乙酯提取TCB、TCB-SO和TCB-SO2。提取液經離心，氮氣吹干，復溶后，供HPLC分析。三種化合物的回收率分別為89.5%、83.1%和82.2%，RSD分別為3.1%、3.5%和4.9%，方法檢測限(LOD)為50ng/mL。Galtier等用乙酸乙酯提取血漿中的TBZ和TBZ-5-OH，蒸干有機相，殘渣溶于流動相采用HPLC分析。Tocco等用0.3mol/L焦磷酸鈉將奶樣調至pH6.0，用乙酸乙酯提取后轉移到0.1mol/L HCI中，用熒光檢測器(FLD)檢測。在添加濃度為0.1～5μg/g時，TBZ和TBZ-5-OH的回收率為95%±6%。Fletouris等還比較了pH在3～11.5范圍內，用乙酸乙酯提取奶樣中10種BMZs的效率。發現在pH 10時大多數藥物的回收率最好，平均回收率在79%～100%之間，但FBZ的回收率較低，在56%～66%之間；整體RSD在2.0%～5.8%之間。

研究發現乙腈也是有效的動物組織中BMZs的提取溶劑。Fletouris等用乙腈在pH2～9的條件下提取奶中FBZ，回收率均接近100%。試驗還表明，用乙腈提取樣品時，pH變化對回收率的影響不大。劉洪斌等凹用含5%乙酸的乙腈提取牛奶中的12種BMZs及其代謝物殘留，用LC-MS/MS檢測，平均回收率在71.4%～101.5%之間，CV小于9.63%。Su等調pH10后用乙腈提取肌肉和肝臟組織中6種BMZs，加入二丁基苯甲醇(BHT)防止TBZ-5-OH氧化，用C18柱凈化，HPLC測定。BMZs的LOD在用二極管陣列檢測器(DAD)檢測時為0.005～0.03mg/kg，用FLD檢測時為0.004～0.02mg/kg；回收率在71%～101%之間，日內和日間CV分別為1.92%和7.22%。夏崇菲用pH2.5的檸檬酸緩沖液和乙腈提取豬肉、豬肝、水產品、牛奶和雞蛋中多種獸藥殘留物，其中14種BMZs及其代謝物的回收率在60.6%～115.1%之間。

也有采用其他溶液提取BMZs的報道。Brandon等用DMSO-H2O(10+90，v/v)從牛肝臟中提取TBZ，用酶聯免疫(ELISA)檢測。方法LOD小于20μg/kg，提取回收率可達97%。該作者還建立了一種從肝臟組織中提取FBZ的方法。用DMF-H2O(10+90，v/v)提取樣品，增加FBZ的溶解量。加入DMF后，能將FBZ的LOD從640μg/kg降至29μg/kg，但沒有說明回收率的變化。Hoaksey等先用乙腈沉淀血漿樣品中的蛋白后，再用二氯甲烷提取ABZ和ABZ-SO。提取液用氮氣吹干，流動相復溶后，供色譜分析。ABZ和ABZ-SO的平均回收率分別為97%和75%；ABZ的日內、日間CV分別在6.7%～9.5%和5.9～8.9%范圍內，ABZ-SO為9.0%～9.4%和7.4%～8.4%。研究發現，盡管用正已烷、乙酸乙酯、乙酸乙酯-正已烷(9+1，v/v)提取ABZ的回收率均大于70%，但是ABZ-SO的回收率均沒有超過70%。Bogan等用磷酸緩沖液調節血漿和胃腸液至pH7.4，再用乙醚提取FBZ、OFZ和ABZ殘留。提取液用氮氣吹干后，用甲醇復溶，HPLC檢測，三種藥物的添加回收率在70%～103%之間。Blanchflower等用甲醇-水(20+7，v/v)提取肝臟和肌肉組織中的FBZ和OFZ，提取液用石油醚洗滌，經磷酸緩沖液稀釋后，再用二乙醚-乙酸乙酯(60+40，v/v)萃取。FBZ和OFZ的回收率分別超過了80%和70%。Kinabo等建立了檢測牛奶中TCB及其代謝物的方法。用丙酮提取奶樣中的藥物，提取液用等量水稀釋后，過C18固相萃取柱凈化，HPLC測定。對TCB-SO2、TCB-SO和TCB的LOD分別為20μg/L、40μg/L和40μg/L，回收率在76%～92%之間。

2)超臨界流體萃取(supercritical fluid extraction，SFE)

SFE是一種將超臨界流體作為萃取劑，把一種萃取物從基質中分離出來的技術。二氧化碳(CO2)是最常用的超臨界流體。Danaher等用未修飾的超臨界CO2(60L，690bar，80℃)從肝臟樣品中提取添加的14種BMZs。提取物用中性氧化鋁柱和SCX柱凈化，再用HPLC檢測。除TBZ、CAM和TCB-SO2不能定量外，其余11種BMZs的平均回收率在51%～113%之間。

3)加壓溶劑萃取(pressurized liquid extraction，PLE)

PLE也叫加速溶劑萃取(ASE)，是在較高的溫度(50～200℃)和壓力(1000～3000psi)下，用有機溶劑萃取固體或半固體的自動化方法。提高溫度能極大地減弱由范德華力、氫鍵、目標物分子和樣品基質活性位置的偶極吸引所引起的相互作用力。液體的溶解能力遠大于氣體的溶解能力，因此增加萃取池中的壓力使溶劑溫度高于其常壓下的沸點。該方法的優點是有機溶劑用量少、快速、基質影響小、回收率高和重現性好。Chen等建立了-種測定豬、牛、羊、雞的肌肉和肝臟中11種BMZs和10種丙硫咪唑、苯硫噠唑和甲苯咪唑代謝物的LC-MS/MS方法。樣品處理采用自動化PLE技術，以憶腈/正己烷作為提取溶劑，選用11mL的萃取池對提取條件進行優化，LC-MS/MS檢測。添加水平為0.5μg/kg時，回收率為70.1%～92.7%，日間RSDs均低于10%；定量限(LOQ)為0.02～0.5μg/kg。

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