苯并咪唑類藥物測定——液相色譜-質譜法

時間：2023-03-24 23:06:26來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

苯并咪唑類藥物測定——液相色譜-質譜法

[db:作者] / 2022-12-21 00:00

(4)液相色譜-質譜法(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)

LC-MS是近年來迅速發展起來的一種痕量監測分析技術，它將HPLC的高效分離能力與質譜的準確定性、鑒別能力結合在-起，實現多種組分的同時分離測定，可以大大縮短分析時間，提高分析測定的靈敏度和準確性。尤其是逐步發展起來的超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)能在取得良好的分析效果的同時，進-步減少溶劑用量，縮短分析時間。

1)液相色譜-單四極桿質譜法(LC-MS)

早期測定動物組織中BMZs殘留多采用液相色譜-單四極桿質譜儀(LC-MS)，其常為熱噴霧電離(TSP)接口、選擇離子(SIM)模式。這種設備的缺點是其應用局限于有一定揮發性、分子量較小的分子，而且需要質譜診斷的離子數量多，TSP的質譜圖化學噪聲高。Blanchflower等建立了LC-TSP-MS測定組織中FBZ和OFZ殘留的方法。用甲醇-水(2+7，v/v)從肝臟和肌肉組織中提取FBZ和OFZ，提取液用石油醚洗滌，磷酸緩沖液稀釋，乙醚-乙酸乙酯(60+40，v/v)萃取，萃取液蒸干，流動相復溶后，LC-TSP-MS測定。分析柱為LiChrosorb RP18反向柱(125mm×4mm)，OFZ流動相為含有0.05mol/L乙酸銨的乙腈-四氫呋喃-水(5+1+4，v/v)，FBZ流動相為含有0.05mol/L乙酸銨的乙腈-四氫呋喃-水(3+1+6，v/v)，流速為1.0mL/min，SIM模式監測，選擇離子為[M+H]+。FBZ和OFZ的平均回收率分別為91%和86%，LOD分別為0.05μg/g和0.1μg/g。研究發現，與梯度洗脫相比，等度洗脫能提供更多可重復的MS結果。Cannavan等用LC-TSP-MS測定了牛肉中TBZ和TBZ-5-OH殘留。色譜柱為Prodigy5 ODS 3(150mm×4.6mm，2um)，采用0.1mol/L乙酸銨和乙腈作為流動相，梯度洗脫，流速1.0mL/min。用氘代TBZ為內標，SIM模式監測，選擇離子為[M+H]+，分別掃描m/z為202、206和218的離子對，測定TBZ、D4-TBZ和TBZ-5-0H。該方法能夠確證50μg/kg的TBZ和TBZ-5-OH，TBZ和TBZ-5-OH的回收率分別在96%～103%和70%～85%之間，CV分別為0.7%～4.8%和3.1%～11.5%。該作者還采用大氣壓化學電離(APCI)方式進行確證，發現APCI能產生四個特征離子，更適合于確證。

2)液相色譜-四極桿串聯質譜法(LC-MS/MS)

最近十多年來，串聯質譜(MS/MS)的應用極大提高了生物樣品中BMZs殘留檢測和確證的能力，大多采用三重四極桿質譜，多反應監測(MRM)模式監測。

陳瑩等采用UPLC-MS/MS建立了同時測定動物組織中噻苯噠唑、奧芬噠唑、甲苯咪唑、三氯苯噠唑和氟苯噠唑等5種BMZs的殘留檢測方法。色譜柱為C18柱，流動相為含0.1%甲酸的乙腈溶液和0.1%甲酸，梯度洗脫，流速為0.3mL/min，電噴霧(ESI)電離，MRM模式監測。方法LOD為0.1～0.5ug/kg，LOQ為0.2～0.7μg/kg。田德金等采用UPLC-MSMS方法檢測動物組織中的FLU、FBZ、ABZ和MBZ。采用乙酸乙酯做提取劑，提取液濃縮后，用乙腈復溶，正己烷脫脂，然后過中性氧化鋁柱凈化，UPLC-MS/MS測定。色譜柱為C18柱，水和乙腈為流動相，梯度洗脫，流速0.25mL/min，ESI正離子、MRM模式監測。方法回收率為60%～85%，平均CV小于15%，LOQ為1μg/kg。郭強等建立了可食性動物組織中阿苯達唑、阿苯達唑-2-氨基砜、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、噻苯咪唑、5～羥基噻苯咪唑、奧芬達唑砜等7種BMZs藥物及其代謝物的多殘留檢測的LC-MS/MS法。分析過程中以保留時間和2個MRM離子對(母離子和2個子離子)進行定性，以峰形好和響應值高的離子進行定量。結果表明，該方法的LOD為2ng/mL，LOQ為10 ng/mL，準確度和精密度都能滿足殘留檢測的要求。De Ruyck等采用LC-MS/MS方法檢測羊肝臟中MBZ及其水解產物(MBZ-OH)和次級代謝物(MBZ-NH2)。色譜柱為反相C18柱，流動相為0.1%甲酸水溶液和乙腈，梯度分離，ESI+電離，以[M+H]+離子作為檢測目標，采用MRM定量。方法LOD低于1μg/kg，回收率高于90%，RSD在5%～11%之間。劉琪等建立了豬肝中14種BMZs及其代謝物的LC-ESI-MS/MS檢測方法。用堿性乙酸乙酯提取，蒸干后用乙醇-0.1moL/L鹽酸溶液(2+1，v/v)復溶，MCX SPE柱凈化，LC-MS/MS測定。用Waters Xterra C18(2.1mm×150mm，5um)色譜柱分離，以0.1%甲酸乙腈溶液和0.1%甲酸溶液為流動相，梯度洗脫，流速0.2mL/min，ESI+、MRM模式檢測。14種BMZs及其代謝物的標準溶液在10～1000μg/L濃度范圍內線性關系良好，R2均大于0.99；方法LOD為5ug/kg，LOQ為10μg/kg；在10～200μg/kg添加濃度范圍內，回收率均在70%～120%之間，批內、批間RSD均小于20%。

De Ruyck等建立了雞蛋中FLU及其代謝物(FLU-HMET 和FLU-RMET)的LC-MS/MS檢測方法。用堿化的乙酸乙酯作為提取液，提取液在60℃蒸至4～5mL，轉至刻度試管，氮氣吹干，殘渣溶于600μL甲醇，混勻后在60℃水浴中加熱5min，用2mL正己烷脫脂1～2次，溶液再用甲醇定容至1mL，并在60℃水浴中加熱2min，過0.2μm聚四氟乙烯濾膜，LC-MS/MS測定。色譜柱為RP-C18柱，乙酸銨緩沖液和乙腈為流動相，梯度洗脫，流速0.25mL/min，進樣量10μL，ESI+電離，以[M+H]+離子作為檢測目標，采用MRM確證，以氯苯并咪唑作為內標，制作基質加標標準曲線定量。方法LOQ約為1μg/kg，總體平均回收率大于77%。

De Ruyck等還建立了檢測牛奶中8種驅蟲藥(包括TBZ、OFZ、FBZ、OXI、ABZ、FEB和TCB)的LC-ESI-MS/MS多殘留檢測方法。色譜柱為C18柱，0.1%甲酸和乙腈為流動相，梯度洗脫，ESI電離，監測[M+H]+離子，用MRM確證，并計算了1μg/kg(禁用藥)和MRL值(限用藥)添加水平的檢測限(CCa)和檢測能力(CCβ)。方法LOD小于0.6μg/kg，回收率在89.6%～102.0%之間，CV在5.4%～11.6%之間。湯娟等建立了LC-MS/MS測定全脂和脫脂奶粉中奧芬達唑、阿苯達唑和芬苯達唑3種BMZs殘留的方法。通過比較不同溶液的提取效率，最終選擇含1%乙酸的甲醇作為提取溶液，正己烷和陽離子SPE兩步凈化，有效去除奶粉基質中的抑制干擾物。以乙腈和含0.5mmol/L醋酸銨及0.1%甲酸的水溶液為流動相，C18作為分析色譜柱，采用梯度洗脫方式進行LC分離。脫脂奶粉和全脂奶粉3個添加水平的回收率范圍為70.0%～85.8%，RSD均小于7.5%，方法LOD為10μg/kg，能滿足現有各國殘留限量要求。

Wojnicz等開發了一種簡單快速的LC-MS/MS方法測定血漿中的ABZ及其代謝物ABZ-SO2。樣品經SPE提取凈化后，以1%乙酸溶液-甲醇(4+6，v/v)為流動相，在Zorbax XDB-CN柱上等度洗脫，ESI電離，MRM模式監測。ABZ和ABZ-SO2的LOQ分別為5和10ng/mL，在LOQ添加水平下，RSD不超過20%。

Whelan等采用LC-MS/MS在MRL水平對TCB殘留進行了定量和定性分析。采用改進的QuEChERS方法提取TCB殘留，ESI質譜分析。常見流動相添加物由于pK。值小于2，造成電離不充分，從而導致線性較差，而使用含有三氟乙酸(pK。0.3)的流動相，形成了TCB代謝產物的質子化準分子離子[M+H]+，可以對肝臟、肌肉和牛奶中TCB殘留在歐盟MRL(分別為250μg/kg、225μg/kg和10μg/kg)下進行確證分析。所有待測物在2.23min內出峰；牛奶和組織中動態線性范圍分別為1～100μg/kg和5～1000μg/kg；肝臟、肌肉和牛奶中CCa范圍分別為250.8～287.2μg/kg、2554.9～290.8ug/kg和10.9～12.1μg/kg。

3)液相色譜-離子阱質譜法(LC-MSn)

從20世紀80年代中期開始，離子阱開始成為有機質譜的質量分析器。單一-的離子阱在空間上用于較大范圍內不同質荷比離子的檢測，在時間上又可以用于串聯質譜，靈敏度較四極桿質量分析器高10～1000倍。與四極桿串聯質譜的不同之處在于四極桿串聯質譜是“空間上”的串聯，而離子阱質譜是“時間上”的串聯。Kai 等建立了檢測動物組織中ABZ、FBZ、ABZ-NH2-SO2、MBZ、OXI、TBZ、TBZ-5-OH、TCB和5-氯-6-(2，3-二氯-苯氧基)-苯并咪唑-2-環戊酮等9種BMZs的LC-MSn方法。用Discovery HS F5五氟苯基鍵和相色譜柱分離，流動相為0.2%甲酸-乙腈(50+50，v/v)，等度洗脫，流速0.2mL/min；LC-MSn在ESI電離、增強離子掃描(EPI)、MRM模式下監測。該方法的LOD為0.005～0.05ng/g。

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